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本研究以具有转化阿魏酸生成香兰素能力的细菌Enterbacter sp.Px6-4为出发菌株,通过设计简并引物和染色体步移(Genome Walking)技术克隆获得了阿魏酸脱羧酶(FADase)的全长编码基因及其上游的调控序列;为了进一步研究阿魏酸脱羧酶的酶学性质,将该酶的编码基因序列克隆到表达载体Pet-28a中,并在E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达;通过亲和层析等方法获得了纯化的阿魏酸脱羧酶并对其酶学性质进行分析;应用气相悬滴扩散法获得了阿魏酸脱羧酶结晶,同时通过阿魏酸脱羧酶和底物类似物阿魏酸钠共结晶获得了复合物结晶;通过X-射线衍射法对晶体结构进行了解析,获得了阿魏酸脱羧酶的空间结构数据,并确定了阿魏酸脱羧酶的活性中心结构以及与底物作用的相关氨基酸;通过氨基酸的定点突变技术分别对阿魏酸脱羧酶中与底物发生作用的4个主要氨基酸进行了定点突变,并对突变的阿魏酸脱羧酶动力学性质进行了分析;最后,结合阿魏酸脱羧酶及其与底物类似物的复合物晶体结构解析以及氨基酸定点突变的动力学分析结果,从原子水平上阐明了阿魏酸脱羧酶催化阿魏酸脱羧生成4-乙烯基愈创木酚的催化机制。
本文的主要结果为:
1.Enterbacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶的全长编码基因及上游调控基因序列的扩增。参考GenBank上报道的来源于不同细菌的脱羧酶编码基因的核酸序列设计了一对简并引物,利用该引物扩增得到Enterbacter sp.Px6-4阿魏酸脱羧酶编码基因的保守序列,根据这段保守序列设计三对巢式PCR的引物,通过染色体步移技术扩增得到阿魏酸脱羧酶的全长编码基因序列及上游调控基因序列。阿魏酸脱羧酶的编码基因全长507个碱基,编码168个氨基酸;该基因的上游调控基因序列全长881个碱基;
2.阿魏酸脱羧酶的异源表达、纯化和酶学性质研究。利用Pet-28a质粒构建了阿魏酸脱羧酶的异源表达载体,并在E coli BL21(DE3)中诱导表达。重组蛋白以可溶形式表达,通过镍离子亲和层析、阴离子交换层析和疏水层析获得了电泳纯的阿魏酸脱羧酶。SDS-PAGE表明纯化的重组阿魏酸脱羧酶分子量为23kDa。该酶的最适PH值为4,最适反应温度为28℃,Cu2+和Hg2+可以抑制该酶99％的活性;
3.阿魏酸脱羧酶的结晶和晶体结构解析。应用气相悬滴扩散法,通过对结晶条件的筛选和优化,最终确定了阿魏酸脱羧酶蛋白结晶的最佳条件为:酶浓度10 mg/Ml,0.1 M HEPES(Ph7.3),27%w/v PEG10000,16℃,培养时间为3～4天。通过X-射线衍射法对阿魏酸脱羧酶的晶体结构进行了解析,晶体衍射的分辨率为2.4(A),该酶在溶液中以同型二聚体的形式存在。单体的轮廓尺寸为:25×25×45(A),由9个D折叠、2个α螺旋和2个η螺旋组成。单个的阿魏酸脱羧酶分子可以分为三个部分:核心部分、螺旋底部和C末端延伸;
4.阿魏酸脱羧酶与底物类似物的复合物结晶和晶体结构解析。采用7mM的阿魏酸钠与阿魏酸脱羧酶共结晶的方法,获得了阿魏酸脱羧酶与底物类似物阿魏酸钠的复合物结晶。该复合物晶体的衍射分辨率达到2.1(A)。复合物的结构解析表明:在同型二聚体中与底物发生作用的仅有1个单体分子;在阿魏酸钠的诱导下阿魏酸脱羧酶的表面形成一个底物结合口袋(8×8×15(A)),Trp25对于底物结合口袋的开关发挥着重要的作用;阿魏酸脱羧酶的活性中心由Tyr21、Asn23、Trp25、Tyr27、Ile41、Leu45、Val46、Ilel32和Glul34组成,其中Asn23、Tyr27和Glul34通过氢键与底物发生作用;
5.阿魏酸脱羧酶的定点突变和突变酶的动力学分析。选择了阿魏酸脱羧酶中与底物催化相关的4个氨基酸Tyr21、Trp25、Tyr27和Glul34,分别进行了氨基酸的定点突变,将其分别突变为Ala21(Y21A)、Ala25(W25A)、Ala27(Y27A)和Alal34(E134A)。通过异源表达获得了相应的突变酶并进行了纯化。突变酶的动力学分析表明:E134A突变后阿魏酸脱羧酶的Km值增加而Vmax值减少;W25A突变后阿魏酸脱羧酶的Km值减少Vmax值也减少;而Y21A和Y27A突变后阿魏酸脱羧酶完全丧失了酶活性;
6.阐明了阿魏酸脱羧酶的脱羧机制。通过分析阿魏酸脱羧酶的活性中心的氨基酸组成、与底物发生作用的相关氨基酸的突变及动力学分析,阐明了阿魏酸脱羧酶的"两步脱羧机制":底物阿魏酸的羟基在Glu134的羧基氧负离子的作用下去质子化,在阿魏酸骨架中产生第一次电子流,使阿魏酸羧基的邻位碳原子上形成了一个亲核中心。由Tyr27的羟基和水分子形成的负电场吸引这个亲核中心,阿魏酸形成醌型的中间体。随后醌型中间体上的羧基形成了第二次电子流,这个电子供体使羧基与阿魏酸的共价键发生裂解,从而生成了4-乙烯基愈创木酚并释放出CO2。
本论文的创新性体现在以下几个方面:
1)首次从细菌Enterbacter sp.中克隆得到了阿魏酸脱羧酶的编码基因及上游调控序列,通过异源表达获得了该酶的重组蛋白并将其纯化,进一步测定了该酶的酶学性质;
2)首次获得了阿魏酸脱羧酶与底物类似物阿魏酸钠的复合物结晶并对该复合物的空间结构进行了解析,阐明了参与底物催化的相关氨基酸及阿魏酸脱羧酶的活性中心结构;
3)首次从原子水平上阐明了细菌Enterbacter sp.阿魏酸脱羧酶的催化机制。