慢性粒细胞白血病(CML)是原癌蛋白BCR-ABL作用于造血干细胞(HSC)发生恶性转化而产生的一类克隆增殖性血液疾病。BCR-ABL融合基因编码的BCR-ABL融合蛋白促进酪氨酸激酶(TK)过度表达,TK主要催化蛋白质酪氨酸酶酸化作用而激活多条细胞传导途径,加速细胞增殖和阻碍细胞凋亡。目前CML治疗主要包括骨髓移植、基因治疗、免疫治疗和分子靶向治疗,尤其是分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂(TKI)备受瞩目。TKI是以阻断BCR-ABL调控的恶性转化为靶点的抑制剂,而且TKI低毒不影响正常细胞,已经广泛应用于血液系统恶性肿瘤的临床治疗。然而,药物耐受问题和TKI对白血病干细胞不灵敏性导致的复发一直阻碍着彻底治愈CML最终理想的实现。因此,深入探索CML白血病干细胞的生物学基础和TKI耐药的分子机制有助于寻找靶向治疗的新靶点。micro RNA(miRNA)是一个长约21nt-23nt的类非编码的小分子单链RNA,主要在转录后调控靶基因的表达,并且参与细胞增殖、凋亡和分化等细胞生物学进程的调节,以及肿瘤的发生和发展。miRNA参与肿瘤的发生主要是通过靶分子识别、miRNAs突变以及扮演癌基因或抑癌基因角色实现的。研究发现众多miRNA参与转化HSC过程,在CML中表达上调或下调,并且调控CML演变中相关靶基因和信号通路,从而影响CML的发生发展。miR-17-92基因簇也称oncomir-1,其基因位于人13q31.3,在血液系统肿瘤和骨髓瘤中存在突变和扩增。前期我们对CML CD34+细胞进行基因芯片和探针Q-PCR筛查发现miR-17-92中的miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92六个成熟miRNA表达升高,但miR-17-92在CML发病中的作用及机制尚不清楚。本研究利用miR-17-92基因条件敲除小鼠,结合BCR-ABL转基因诱导的CML模型,评价miR-17-92簇在CML中的作用及机制。首先,我们阐明CML中c-Myc通路调控miR-17-92诱导的BCR-ABL活性。利用si RNA沉默技术和Lipofectamine?3000,c-Myc si RNA转染CML细胞系KCL22细胞。Q-PCR法检测c-Myc表达,再利用Taqman探针定量PCR法检测miR-17-92表达,结果发现si RNA沉默c-Myc后KCL22细胞中miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b表达明显下调。以上结果证实c-Myc调控了BCR-ABL诱导的miR-17-92表达上调。其次,我们确定miR-17-92在CML细胞增殖和凋亡中的调控角色。将miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92抑制剂转染CML细胞系K562细胞,利用CCK-8检测细胞增殖,流式细胞仪检测Annexin-V APC/PI染色的细胞凋亡,结果发现miR-17-92抑制剂减少细胞增殖和增加细胞凋亡。结果说明在CML中miR-17-92发挥促癌基因作用。再次,我们通过将表达BCR-ABL融合基因的逆转录病毒感染miR-17-92敲除小鼠骨髓细胞并建立CML小鼠模型,明确miR-17-92在BCR-ABL诱导的白血病生成和发展中的相关作用。利用Q-PCR检测miR-17-92敲除小鼠骨髓细胞中miR-17-92簇敲除效率,结果发现敲除小鼠骨髓细胞中miR-17,miR-18a,miR-19a,miR-20a,miR-19b和miR-92表达比野生型(WT)小鼠明显下调。敲除小鼠中B细胞减少,说明miR-17-92对B细胞生长很重要并不影响骨髓造血作用。WT小鼠和miR-17-92敲除小鼠作为供体小鼠,移植前通过尾静脉注射5-FU。将两组供体小鼠骨髓细胞体外培养,给予造血生长因子预刺激和BCR-ABL逆转病毒(P210)的感染,分别通过尾静脉注射移植于经过γ射线照射过的的同种正常受体小鼠。建模后对两组小鼠进行体征观察,血细胞计数仪检测外周血白细胞,流式细胞仪检测外周血单个核细胞GFP表达,并对发病小鼠肝脏、脾脏进行称重和病理检测。CML模型结果显示出两组差异性,一组是移植P210感染的miR-17-92敲除小鼠骨髓细胞组(K组),另一组是移植P210感染的WT小鼠骨髓细胞组(N组)。所有接受P210感染细胞的移植小鼠都发展成CML并在30天内出现外周血中GFP高表达。N组小鼠外周血中GFP表达比K组升高,N组小鼠白细胞升高也早于K组小鼠。发病小鼠脾脏代偿性增大,而K组小鼠脾脏重量大于N组小鼠脾脏,病检发现两组发病小鼠肝脾正常结构破坏,肝脏组织中肝小叶结构不完整,肝束排列拥挤,弥漫可见巢状淋巴样组织浸润并伴有圆形或卵圆形淋巴样细胞,脾脏组织中白髓明显增多,红髓明显减少,明显可见白细胞成分。经过对CML模型小鼠存活率的统计,K组小鼠存活率明显提高,移植后70天具有30%以上存活,而N组移植后40天内全部死亡。以上结果证实了沉默miR-17-92抑制CML中BCR-ABL致癌性转化的活性,延迟了CML发病。最后,阐明miR-17-92调控白血病生成机制。我们鉴定CML细胞中A20(TNFAIP3)作为miR-19b靶基因。Q-PCR结果发现K组骨髓单个核细胞中A20表达比N组上调。利用Target Scan在线分析软件预测特异性靶向A20基因3’-UTR的miRNA包括miR-18a、miR-19a和miR-19b,通过退火、酶切和胶回收后构建报告基因载体p GL3-A20-miR-18和p GL3-A20-miR-19a/b,分别与miR-18a、miR-19a和miR-19b mimic共转染293细胞,双荧光素酶报告基因检测法结果显示A20 3’-UTR miR-19b组荧光素酶活性明显降低。WB结果证明K562和KCL22细胞中miR-19b抑制剂、伊马替尼(Imatinib)上调A20表达,相反过表达miR-17-92下调A20表达。Q-PCR法检测发现A20在CML CD34+细胞中表达比正常人CD34+中下降,而经Imatinib处理后升高。以上结果提示CML细胞中A20表达下调依赖BCR-ABL的活性。明确A20调控CML细胞增殖和存活作用。磷酸钙沉淀法包装过表达A20慢病毒并感染K562、KCL22和CML CD34+细胞进行鉴定,Q-PCR和WB结果发现过表达慢病毒组A20表达升高,提示慢病毒包装成功。过表达A20慢病毒感染CML CD34+细胞,利用Dye670、Hoechst33342、Annexin-V APC/PI染色和流式细胞仪分别检测细胞增殖、周期和凋亡,并用半固体培养基体外培养BFU-E和CFU-GM,CFU-GEMM集落,结果发现过表达A20抑制增殖和集落形成,增加细胞周期G0/G1期比例、降低S期比例,并促进细胞凋亡增加。由此说明A20在CML细胞中具有抑癌基因作用。为了探索A20影响CML细胞特性的机制,我们将过表达A20和miR-17-92慢病毒感染CML细胞。WB检测发现过表达A20减少K562、CML CD34+细胞P65、IκBa磷酸化表达,过表达miR-17-92增加K562细胞P65、IκBa磷酸化表达,而在KCL22细胞中变化不明显。因此,CML中A20通过抑制P65、IκBa磷酸化表达而负调控NF-kB信号通路。综上所述,我们证明了miR-17-92通过靶基因A20调控NF-κB参与BCR-ABL诱导的造血干细胞恶性转化和CML发病。本研究阐明miR-17-92促进CML发生的调控机制具有一定的创新性,为今后miR-17-92基因靶向治疗CML提供新的策略。