来源于农林废弃物的木质纤维素是非常丰富的可再生资源,对其进行开发利用有助于降低经济发展对石油的依赖程度并减少二氧化碳净排放量,符合国家“十三五”规划中“绿色发展”的理念。木质纤维素的微生物利用一般需要经过水解糖化；水解过程中产生低聚糖、纤维二糖、葡萄糖、木糖等较低碳原子数的糖类,以及糠醛、酚类等多种会抑制微生物生长的副产物,这对微生物利用该可再生资源提出了挑战。至今,木质纤维素水解液发酵常使用之前用于玉米淀粉水解液发酵的菌株,存在菌株难以适应木质纤维素水解液的严苛环境、发酵效率不高这些困境。为此从2007年开始,本实验室尝试结合育种、发酵策略优化及代谢工程改造等手段,就木质纤维素水解液发酵生产有用产品(比如,乙醇),进行了菌株构建和发酵工程的一系列研究。本学位论文首先进行了定向性的菌株筛选,其特点是使用含水解液中的常见抑制物--糠醛、羟甲基糠醛(HMF)和乙酸作为培养基的成分。通过从各地土壤、水样中筛选和驯化,最终获得了一株可代谢葡萄糖、木糖等多种碳源并可在含抑制物培养基中正常生长的酵母菌株。通过对该菌株的18s rRNA测序与数据库比对确定其为一株季也蒙氏毕赤酵母(Pichia guilliermondii)。进一步将该菌株用于玉米芯稀酸水解液发酵,证明其可直接利用不脱毒半纤维素水解液生产木糖醇,且过程中不需要添加其他营养物质,木糖醇产量可达20 g L-1以上。值得注意的是,在HMF降解实验中发现该菌株在20h内可完全降解高达6g L-1的HMF,其耐受浓度和脱毒效率均高于其它已报道的酵母菌株。该特性可能与其降解HMF过程中细胞除具有NADPH依赖的醛脱氢酶活性外、还表现出HMF氧化酶活性有关。在上述工作基础上,本学位论文尝试以来自山东某企业的脱去半纤维素后的玉米芯残渣为原料,进行季也蒙氏毕赤酵母厌氧发酵生产乙醇的研究。该菌株可在玉米芯残渣水解液中正常发酵产乙醇；但同时观察到,细胞内活性氧(ROS)在发酵100h左右开始积累,细胞活力(viability)下降。为提高水解液的发酵效率,论文进一步研究了如何提高发酵过程中细胞的抗氧化能力。因为在细胞合成抗氧化酶途径中,生物素是其前体卟啉合成的重要辅因子之一,论文设计了提高胞内生物素储量的策略,并考察是否可由此获得抗氧化能力增强的细胞。实验结果证实,在种子培养基中添加200μg L-1生物素时(IBP200),细胞内生物素储量可提高至12.5±1.6μg mg protein-1,为对照细胞的2.4倍；在水解液厌氧发酵过程中,IBP200细胞内卟啉含量在90h后逐渐提高,120h后比对照高24%；与之相对应,抗氧化酶活性也升高至对照的1.8倍。最终,IBP200细胞发酵中胞内ROS降低为对照的54%,且细胞活力在发酵190h后仍维持在70%以上,显著高于对照组,乙醇产量比对照组提高了28%。进一步使用IBP200细胞进行了玉米芯残渣水解液的循环发酵,三个循环过程中乙醇平均生产率可达0.9 g L-1 h-1,乙醇浓度高达55.5至59.2 g L-1,优于以往的报道结果,也使该过程显示出潜在的应用价值。实验室研究过程中注意到季也蒙氏毕赤酵母为克拉布特里阴性(Crabtree-negative)酵母,其糖代谢在有氧发酵条件下倾向于呼吸代谢和菌体生产,乙醇合成能力很弱；而酿酒酵母等克拉布特里阳性(Crabtree positive)酵母在葡萄糖浓度增加(或当糖酵解增加)时,细胞的呼吸受到抑制,有氧条件下可产乙醇。那么,有否可能进行该季也蒙氏毕赤酵母的代谢改造改变其葡萄糖代谢特性?这是一个有趣的科学问题。基于这种好奇性,本论文尝试从建立其遗传改造平台出发、进而改造其糖代谢途径。首先,通过自然突变从出发野生菌获得了一株尿嘧啶缺陷株,并通过回补该营养缺陷和插入突变获得一株葡萄糖信号转导途径转录调控因子CAT8的突变株(ACAT8)。开展含葡萄糖的合成培养基以及不脱毒水解液的好氧发酵实验,结果表明ΔCAT8突变株的比耗氧速率明显降低,乙醇积累显著增加,但产量仍比较低。通过对主代谢的基因转录分析,结果表明突变株三羧酸循环和呼吸链的相关基因转录受到抑制。以上结果表明CAT8在季也蒙氏毕赤酵母葡萄糖代谢调控中发挥重要作用,其突变导致该克拉布特里阴性酵母表现出类似克拉布特里阳性酵母中的代谢特性。综上,本学位论文工作通过菌种筛选驯化获得了一株具较强纤维素水解液抑制物耐受性的菌株P.guilliermondii,并建立了该菌株的基因操作平台。同时通过发酵工程研究,在玉米芯残渣水解液的厌氧循环发酵中,所获得的乙醇产量高于以往文献报道。本论文提供的抑制物降解、水解液发酵策略以及糖代谢调控相关信息预期可为其他菌株,尤其是克拉布特里阴性酵母的研究和应用提供良好借鉴。