研究背景喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,临床的主要症状为:声嘶、咳嗽、吞咽及呼吸困难、颈部淋巴结转移等。喉癌与其他恶性肿瘤一样,是严重危及生命的疾病。多基因,多因子相互作用的结果导致喉癌病发,所以喉癌也是当前医学领域肿瘤防治工作中的一大难点。有研究证明,早发现早治疗可以提高喉癌术后存活率,减少并发症,然而,大约60%喉癌患者直到第三或第四阶段才发现已患病。近些年虽然总体发病率下降,但是患者5年内的存活率却在下降。临床治疗喉癌的技术水平飞速提升,但是治疗效果仍不理想,而且还会带给患者许多不良反应。研究者发现存在于人体内的一些细胞因子等生物剂能起到增强肿瘤细胞对放疗的敏感性,如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNFα）,主要由巨噬细胞产生,是损伤部位释放的一个重要炎症因子。一方面,其可以介导恶病质,对肿瘤细胞可以产生细胞毒,诱导β-2干扰素、产生IL-1等,使其有多种生物学活性。肿瘤组织内的肿瘤坏死因子以自分泌的方式分泌,其诱导CXL12、VEGF的生成,间接使肿瘤生长和增殖。另一方面,肿瘤坏死因子α也是目前最强的抗肿瘤细胞因子。它通过抑制细胞凋亡或杀死肿瘤细胞,以及通过多种信号途径增强免疫,在抑制肿瘤进展方面起着关键的作用。Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）属于模式识别受体家族,至今在人类基因组中已发现10个Toll样受体。Toll样受体是连接适应性免疫应答和天然性免疫的桥梁,它通过感受不同生物的刺激,招募特异性接头蛋白,从而激活信号级联反应,引发相应的免疫应答。Toll样受体4是Toll样受体家族中最早被发现的病原模式识别受体,其信号影响大部分微生物引起的先天性免疫反应。TLR4分子的N端有16-28个多个亮氨酸的重复序列,用来识别PAMPs,在其C端包含Toll/IL-1受体结构域,主要作用是激活下游信号通路。癌症是当前危害人类健康的主要疾病之一。患者间的个体差异更是目前临床治疗所面临的一大挑战。高通量测序技术能检测染色体结构变异、拷贝数变异、序列信息变异等基因组水平遗传变异,也可以分析DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传学状态,还可以结合RNA-seq、ChIP-seq等相关技术分析基因的表达调控。高通量测序可以一次性获得大量多维的数据,在分子生物学水平上对癌症进行全面系统的研究,用科学统计分析方法,发现肿瘤相关的基因组突变或修饰信息,开发用于癌症预防、诊断和治疗的新技术及新手段。研究目的本研究以喉癌HEp-2细胞相关的基因m RNA和Lnc RNA表达谱数据为分析材料,我们运用基因注释工具GATHERR（Gene annotation tool to help explains relationship）在线软件（http://gather.genome.duke.edu/）对喉癌HEp-2细胞基因进行GO（Gene Ontology,基因分类）功能分析。应用图形化网络显示及分析编辑软件Cytoscape中的一个插件JEPETTO（Java Enrichment of Pathways Extended To Topolgy）（Version 1.3.1）进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书数据库）通路分析,采用STRINGC（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins）在线软件（http://string.embl.del/）绘制相关基因表达蛋白的互作网络图,并筛选出关键基因。本实验可以阐明肿瘤坏死因子α对的HEp-2细胞影响的分子机制和有关信号通路。研究方法1、HEp-2细胞培养将HEp-2细胞接种于6孔细胞培养板上,细胞贴壁后,弃去培养基,分别用肿瘤坏死因子α（100 ng/m L）和磷酸盐缓冲盐水处理,并于37℃的5%CO ₂的恒温培养箱中培养24 h。设置实验组和对照组,并进行分别标记。2、差异表达分析本研究用Trimmomatic删除FASTQ文件中低质量HEp-2的RNA-seq数据。读取的数据映射到分析工具HISATA进行分析mRNA和LncRNA。在此过程中,最多允许两个值不匹配,其他所有参数均使用默认值,将映射得数据组合,使用StringTie v1.3.1c.量化,得到FPKM的表达式值矩阵,在随后的数据分析前,每个FPKM值前都添加一个值（0.01）。所有的统计分析都是使用R语言软件进行,利用阈值变化大于1.5得到上调差异表达基因（DEGs）。利用R语言软件进行DEGs的聚类分析和热点图分析。3、GO和KEGG通路分析本研究选择较广泛的DAVID在线软件（DAVID 6.8;https://david.ncifcrf.gov/）分别对HEp-2细胞的上调和下调差异表达基因进行GO功能富集分析（P<0.05）。之后,我们整理了HEp-2细胞的差异表达基因,应用在线生物工具KEGG Mapper 83.0（http://www.kegg.jp/kegg/mapper.html）进行KEGG通路分析,探索差异表达基因参与HEp-2细胞的生物学通路。4、蛋白质到蛋白质网络的构建本研究将HEp-2差异表达基因导入STRING在线搜索工具（https://string-db.org/）,绘制基因编码蛋白质的相互作用网络图,删除与其他蛋白之间的无相互作用节点后,可得到差异表达基因蛋白质互作网络图,之后将STRING数据库的差异表达基因的PPI数据导出,将其文本格式导入Cytoscape软件中,利用其插件GenetiScape计算网络及各节点的拓扑特性。5、Western blotting印迹法应用Western blot方法分析含有肿瘤坏死因子α和不含有肿瘤坏死因子α处理的HEp-2细胞组织中的蛋白质的表达:配浓缩胶和分离胶,取等量的组织蛋白分别混合SDS上样缓冲液进行蛋白质电泳,经转印,牛奶封闭,孵育一抗,二抗,显色曝光,显影,定影,最终结果采用灰度分析定量分析表达差异。研究结果1、与癌旁组织相比,肿瘤坏死因子α在人喉癌组织中高表达,而且用肿瘤坏死因子α（100 ng/mL）处理HEp-2细胞24h,并比较了肿瘤坏死因子α处理组和对照组之间基因转录表达的变化。结果显示,2811个m RNA上调,1128个mRNA下调。2、使用NGS（高通量测序技术）获得RNA-seq数据并对显著的DEGs进行鉴定。使用显示DEGs表达的热点图、聚类分析,将肿瘤坏死因子α处理与对照组区分开。3、通过对上调的DEGs进行了GO分析,并建立了蛋白质互作网络图。结果表明肿瘤坏死因子α处理通过上调关键基因而加速了HEp-2细胞周期以及增殖。4、使用GO富集分析和KEGG信号通路分析,发现与细胞存活,细胞周期和增殖相关的NF-κB,MAPK和PI3K-Akt通路被上调,且明确了NF-κB在MAPK和PI3K-Akt信号通路的下游。5、TLR4和NF-κB1的表达水平显著升高,在肿瘤坏死因子α处理组中,包括MYD88,IRAK1和TAB在内的TLR4下游受体的基因都显著上调,而且与癌旁组织相比,TLR4在人喉癌组织中也高表达。6、为了进一步证实,使用免疫印迹来鉴定肿瘤坏死因子α处理组中的TLR4蛋白表达水平。结果表明,肿瘤坏死因子α（100 ng/mL）处理24 h显著增加TLR4蛋白表达。7、通过LncRNA差异表达分析,发现8个LncRNA上调,6个LncRNA下调;研究结论本研究验证了肿瘤坏死因子α处理上调了许多参与细胞周期和DNA复制的关键基因mRNA表达和LncRNA的表达。此外,TLR4,NF-κB,MAPK和PI3K-Akt信号通路也增加,这些增加可能会增强肿瘤坏死因子α诱导的HEp-2细胞增殖和生长。我们的研究结果表明肿瘤坏死因子α可能在喉癌的发展中起关键作用。