目的艾滋病是目前对人类社会威胁最大的传染性疾病之一。由于HIV-1存在高水平的遗传变异性,尽管抗病毒药物已经普遍应用于艾滋病的治疗,但多年来艾滋病的防治及疫苗的研究并未取得突破性进展。最新评估报告表明,男男性传播已成为HIV-1感染的重要传播途径,男男同性恋是我国今后要重点关注和防治的人群,而且我国人群的遗传背景又与欧美及非洲人种明显不同,其免疫应答极有可能有新的特点。但目前我国对于男男同性恋人群感染HIV-1的分子流行病学等研究还非常有限,针对我国男男同性恋中HIV-1感染者的疫苗和治疗研究缺乏HIV病原学免疫学等基础资料的支持,因此了解男男同性恋原发感染者体内transmitted/founder virus的生物学和基因组特征及病毒进化和传播关系,是今后对于HIV-1高危人群开展防治工作的必要前提。本研究选取21例我国辽宁省男男同性恋人群中HIV-1原发感染病例,采用SGA/S方法获取病毒全基因组序列,从病毒全基因组水平分析男男同性恋人群中HIV-1原发感染者的流行趋势及感染早期病毒的遗传变异水平,明确HIV-1感染早期毒株的病毒学特征,预测原发感染者早期I型人类白细胞抗原限制性细胞毒性T淋巴细胞表位并分析其氨基酸多态性,分析与不同疾病进展过程相关的免疫应答特征,为我国HIV-1感染的预防、诊断、监测和治疗提供重要的数据支持。材料和方法1、研究对象21例从2008年10月开始对800例自愿接受咨询检测的辽宁MSM高危人群队列按1.5个月的随访频率筛查出的原发感染病例。原发感染病例入选标准：进行血清学ELISA筛查实验和WB确认实验,对血清学检测阴性者进行集合PCR核酸检测,满足以下一项或多项条件者①在6个月内HIV抗体开始变阳性者②HIV抗体阴性但HIV RNA阳性者③HIV抗体弱阳性但在两周之内可以重复并OD值较前次升高者④有早期HIV感染的临床症状、HIV抗原阳性及WB抗体检测少于4条蛋白带者。EDTA抗凝收集全血样本,4小时内分离血浆,-80℃冻存。2、血浆样本RNA的提取病毒载量大于104c/ml的血浆样本,直接参照QIAamp(?)Viral RNA Mini Kit (Qiagen)提取病毒RNA。对于载量小于104c/ml的血浆样本,先进行富集(4℃,23600g离心1小时)以获得浓度较高的血浆RNA,再参照QIAamp(?)Viral RNA Mini Kit (Qiagen)提取RNA。以280ul血浆提取病毒基因组RNA,提取物溶于60ul洗脱液中。3、逆转录逆转录反应体系基于SuperScript(?)ⅢReverse Transcriptase Kit (invitrogen)说明书,分两段逆转录获得HIV-1全长基因组。4、SGA方法Nested-PCR对cDNA样本进行极限稀释,根据泊松分布,使PCR扩增产物阳性率小于30%的cDNA稀释度能够确保每个阳性扩增产物中仅有单一样本的可能性大于80%。故本实验用Nuclease-Free Water倍比稀释cDNA,每个稀释浓度均做8个平行孔,进行套式PCR扩增,直至扩增阳性孔少于3个,以保证每个孔中为单一模板扩增产物。PCR扩增体系基于Platinum(?)Taq DNA Polymerase High Fidelity Kit(Invitrogen)说明书,分两段套式扩增HIV-1 cDNA全长基因组序列。5、测序及分析使用ABI3130全自动DNA测序分析仪,根据双脱氧终止法用28个引物双向测通HIV-1约9KB的近全长基因序列。用Contig Express (vision 9.0)进行原始的清理和全长基因拼接,出现双峰时,次峰超过主峰的一半,认定该位置为混合碱基。用Bioedit (vision3.3)将序列与HIV DataBase中的参考序列定序进行比较,转换为氨基酸序列,分析变异位置及有无规律性。用MEGA4.1软件以Kimura双参数方法构建全长、env和gag Neighbor-Joining系统进化树,Maximum composite likelihood方法计算序列间的基因距离。6、细胞嗜性分析通过V3环特异的氨基酸并结合网络工具PSSM预测感染毒株的细胞嗜性,在V3环第11至25位氨基酸为S/GXXXGPGXXXXXXXE/D、带正电荷的氨基酸(R/K/H)与带负电荷的氨基酸(D/E)数目差小于5时,可判断为CCR5;如果11和25位氨基酸为R或Q、带正电荷的氨基酸(R/K/H)与带负电荷的氨基酸(D/E)数目差大于5时,可判断为CXCR4。7、Env氨基酸及糖基化位点数目分析用Bioedit软件结合网络工具N-GlycoSite分析计算样本Env蛋白各区氨基酸长度多态性及糖基化位点数目。以RCSB Protein Data Bank蛋白数据库中的HIV-1蛋白三维立体结构为模型利用网络工具SWISS MODEL,构建本实验样本的蛋白三维立体构象。8、HLA-I限制性CTL表位的预测利用网络工具IEDB Analysis Resource,根据本实验室前期获得的患者HLA-I等位基因分型信息,预测样本的HLA-I限制性CTL表位,选取其中IC50低于50nM的表位进行多肽特征和变异分析。9、统计学分析应用SSPS16.0进行统计学分析,病毒载量均转换为对数进行比较。载量、CD4细胞数目、特殊氨基酸和糖基化位点数等不符合正态分布,选取Spearman为相关参数进行两个变量相关分析,P<0.05为显著相关；用非参数秩和检验Wilcoxon参数分析,P<0.05有显著性差异。结果1、病例人口学信息及基本临床特征本实验纳入的21例辽宁MSM人群HIV-1原发感染病例,其中19例为CRF01-AE亚型,1例CRF07-BC亚型,1例B亚型。除1例有异性接触史外,其余均为同性接触感染,并对2对有传播关系的病例进行了纵向两个采样点观察。2、SGA/S21例原发感染病例,其中2对病例进行了2个时间点采样,共采得25个时间点血样,并且对于扩增获得缺陷序列的部分毒株又进行的重复验证实验。通过此种方法共扩增测序得到22条近全长基因组序列,5条3’端半分子序列,全长基因序列为9kb左右,半分子序列为4.5kb左右。在所有扩增得到的序列中共有3条缺陷序列,两条序列缺失接近500bp碱基,一条序列Env V3环缺失顶端四肽,缺陷序列均是3’半分子,占总数的6%,其余序列均有完整读码框架。另外,在所有用SGA/S方法获得的序列中仅有2条含有混合碱基,占总数的4.3%。3、病毒进化及传播关系使用Mega4.1构建Neighbor-Jioning基因系统进化树,发现本实验获得19条CRF01AE亚型序列明显分为两个基因簇,分别与辽宁早期分离的性传感染HIV-1的毒株及我国东南沿海地区流行毒株在一个基因簇上。有性伴关系的两对CRF01AE亚型病例gag、env和全长基因序列与本实验其他CRF01AE亚型病例gag、env和全长基因序列通过BioEdit软件进行比对,使构建Neighbor-Jioning基因系统进化树,其中一对病例各采样点序列集中在一个基因簇上,结合本实验室临床流行病学资料,其为同源毒株感染；但另一对病例2个采样点的4条序列却分散在多个基因簇上,结合本实验室临床流行病学资料,初步认为其中一例病例可能同时感染了两株CRF01AE亚型病毒。4、Env蛋白各区多态性和糖基化位点数目19例CRF01AE亚型原发感染病例Env蛋白V1V2区、V1至V4区糖基化位点数目与set point病毒载量水平呈负相关。比较其中处于同一进化分支上的15例辽宁CRFOIAE亚型原发感染病例与25例亚洲HIV-1 CRF01AE亚型异性接触慢性感染病例,发现原发感染病例V1V2区氨基酸数、V1至V4区氨基酸和V1至V4区糖基化位点数多于慢性感染病例,并且差异均具有显著性。为了解氨基酸的变异是否会对病毒蛋白构象产生影响,本实验以RCSB Protein Data Bank蛋白数据中通过X射线衍射获得的HIV-lgp160蛋白三维模型3jwdA为模板,构建21例样本的C4区蛋白三维结构图,发现有一例样本gp120 C4区糖基化位点N448出现天冬氨酸替代现象,造成了gp120 C4区蛋白结构的改变,并且与N488糖基化位点完好的病例相比,病毒载量下降很快,set point病毒水平较低,CD4+T细胞数目维持在较高的水平。同时发现一对已确定具有传播关系的同源毒株感染样本在gp120 V4区存在长度多态性,也导致蛋白结构上的差异,并且两者之间病毒载量水平有明显差异。通过分析V3环氨基酸多样性发现在所有21个实验样本中,10例V3环顶端四肽为GPGR,8例为GPGQ,2例为GPGK,1例缺失V3环顶端四肽；除了1例样本因有移码突变不能判断嗜性外,18例感染毒株为CCR5嗜性,仅有2例感染CXCR4嗜性毒株,并且发现细胞嗜性为CRCX4的两个样本载量维持在较低水平。5、19个CRF01AE亚型HLA-I限制性Gag, Pol和Nef蛋白CTL表位及其多态性的预测以set point病毒载量104copies/ul等级为界分组,Gag、Pol和Nef区蛋白表位数目在两组间均没有显著性差异；而Pol区表位数目与set point载量水平呈正相关,R=0.519, P=0.016(Spearman)。由同源毒株感染的具有传播关系的一对样本早期HLA-I限制性CTL表位数目存在明显差异,并且与病毒载量水平呈负相关。同时预测21个样本的78个CTL表位各位点的氨基酸多态性,发现HLA-I限制性CTL表位变异明显,9肽CTL表位第2、第5和第9位氨基酸变异率较高。结论一、SGA/S方法可以获得原发感染者体内HIV-1单一毒株。二、辽宁地区MSM人群HIV-I原发感染以CRF01AE亚型为主,此外还可见少数B及CRF07BC亚型,并且CRF01AE亚型中明显分为两个分支,分别与我省和东南沿海HIV-1感染人群亲缘关系近。三、辽宁地区MSM人群原发感染HIV-1 Env蛋白某些氨基酸长度多态性及特殊位点的变异会改变蛋白结构,影响免疫识别。四、在辽宁地区MSM人群中引起感染的HIV-1毒株以CCR5嗜性为主；也发现CXCR4嗜性毒株的传播,但其病毒载量水平都相对较低。五、辽宁地区MSM原发感染者HIV-1早期预测到的HLA-I限制性CTL表位变异明显,在个别同源毒株感染的病例中发现CTL表位数量变化与病程进展相关。