玉米体细胞胚胎发生相关基因ZmSERF1和ZmYUCCA5的研究

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玉米(Zea mays L.)作为我国重要的作物之一,其产量对国家农业的经济发展起着重要作用。因此,多途径创新玉米新种质选育玉米新品种已成为当前农业关注的重要问题。在玉米遗传转化技术中,优良的转化受体材料至关重要。体细胞胚胎因其具有双极性、无性系变异小、稳定性高、分化及移栽成活率高等特点成为植物遗传转化的良好受体材料,而玉米的体细胞胚胎形成较为困难,其发育过程的研究仍相对较少,所以玉米体细胞胚胎发生相关基因的研究,对于玉米的遗传转化能否成功具有重要的意义。本研究在玉米自交系Y423表达谱研究基础上,对其表达量变化较大的2个基因ZmSERF1和ZmYUCCA5进行研究,克隆并构建了2个基因的相应表达载体,并对ZmSERF1基因的功能进行了研究,为今后深入研究奠定基础,研究结果如下:1.以玉米优良自交系Y423诱导的体细胞胚胎为材料,成功克隆到840bp的ZmSERF1编码序列。通过对多种不同植物的ERF蛋白序列进行比对,发现其AP2/ERF结构域具有高度的保守性,玉米ZmSERF1与MtSERF1蛋白序列相似度为34.55%,与拟南芥AtERF1蛋白序列相似度为42.96%。2.成功构建植物过表达载体pCAMBIA3301-35s::ZmSERF1,分别转化野生型和突变体拟南芥,获得T3代转ZmSERF1的过表达拟南芥株系和突变体恢复系。同时进行体细胞胚胎诱导能力测定分析,结果表明异位表达ZmSERF1基因可恢复突变体的诱导能力,过表达该基因提高了体细胞胚胎的诱导能力。由此初步表明ZmSERF1基因在体细胞胚胎发生过程中具有重要功能。3.成功构建干扰载体p3301-UBI-SERF1(+)-intron-SERF1(-),通过农杆菌介导法将过表达载体,pCAMBIA3301空载,干扰载体转化Y423诱导的体细胞胚胎中,通过对当代筛选体细胞胚胎状态的表型比较,结果表明干扰载体侵染的体胚在筛选过程中的褐化死亡率较高,为51.88%,产生新鲜抗性体胚率较低,为17.73%。4.成功构建酵母表达载体pGBKT7-ZmSERF1,结果表明ZmSERF1蛋白对酵母细胞无毒性作用,同时对报告基因在3-AT为40mM/L时可抑制其自激活现象,并筛选得到8个候选互作蛋白。成功构建亚细胞定位载体pSATN1-GW-ZmSERF1,将其转入玉米叶片原生质体,结果表明ZmSERF1蛋白定位于细胞核上。5.以玉米优良自交系Y423诱导的体胚为材料,成功克隆到1236bp的ZmYUCCA5编码序列,并进行生物信息学分析;构建过表达载体pCAMBIA3301-35s::ZmYUCCA5,将其转化野生型拟南芥,获得T2代转ZmYUCCA5的过表达拟南芥株系;构建酵母表达载体pGBKT7-ZmYUCCA5,结果表明ZmYUCCA5蛋白对酵母细胞无毒性作用,同时对报告基因没有自激活现象,并筛选得到1个候选互作蛋白;成功构建亚细胞定位载体pSATN1-GW-ZmYUCCA5,将其转入玉米叶片原生质体中,结合预测结果表明ZmYUCCA5蛋白初步定位在叶绿体上。
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