论文部分内容阅读
研究背景支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，以可逆的气流阻塞、气道高反应性(airway hyperresponsiveness，AHR)、气道炎症和重构、气道黏液分泌等为特征。目前普遍认为哮喘的主要发病机制之一是Th2占优势的Th1／Th2免疫反应失衡。近10年来大量动物试验、流行病学调查及临床试验等证实，卡介苗(bacillus Calmette-Guerin，BCG)是一种很强的Th1免疫刺激剂，能够提高Th1细胞因子(如IFN-γ)等的表达，而抑制Th2细胞因子(如IL-4／IL-5)的表达，使变态反应性炎症向Th1型转变，抑制哮喘气道的嗜酸性粒细胞(eosinophil，Eos)浸润和AHR，并能够降低杯状细胞(goblet cell，GC)的增生和化生(goblet cell hyperplasia／hypertrophy，GCH／M)，抑制GC的肥大，减少黏液的形成，对哮喘有预防和治疗作用。动物试验多在过敏原致敏前或激发前接种，少数在其后接种，目前国内未见BCG在致敏时接种的报道。国外有研究发现，BCG与屋尘螨一起应用于小鼠后成功地抑制了屋尘螨激发的气道高反应性，而单独应用BCG未能发现此种效应。另外数项研究提示BCG致敏时接种动物，BCG与变应原产生协同效应，能够有效抑制变应原引起的AHR、Eos浸润、IgE产生及其他气道炎症改变，但具体机制不十分清楚，而且未见关于比较致敏时与致敏前接种抑制哮喘炎症效应的研究。研究目的在我们已经建立的成熟哮喘模型基础上，给小鼠分别在致敏时和致敏前以不同剂量多次接种BCG，观察其对哮喘小鼠气道炎症及黏液分泌的影响，从而比较致敏时与致敏前接种效应的差异，并探讨其可能的机制。研究方法选择C57BL／6小鼠，6～8周龄，体重18～22克。小鼠分6组：模型组：以卵白蛋白(ovalbumin，OVA)为抗原进行致敏和激发，建立哮喘模型；阴性对照组：以生理盐水代替OVA；BCG接种组：共4组，分别以10~5、10~6集落形成单位(colony-forming units，CFUs)于两次致敏前、两次致敏时腹腔接种：A1组：10~5CFUs致敏前接种；A2组：10~6CFUs致敏前接种；B1组：10~5CFUs致敏时接种：B2组：10~6CFUs致敏时接种；BCG接种组的致敏和激发均同模型组。在最后一次抗原激发后48小时收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和外周血(peripheral blood，PB)，分别测定BALF中白细胞总数、Eos比例及绝对值；PB及BALF中IL-5、IFN-γ浓度；病理观察肺组织炎症及气道粘液分泌情况，分别以杯状细胞化生指数(goblet cell hyperplasia ratio，HR)——指每毫米(mm)长气管上皮中杯状细胞数目、上皮黏液储备指数(epithelial cell mucus occupying ratio，MOR)——上皮过碘酸—雪呋(PAS)阳性染色面积比气管上皮总面积，作为气道黏液的定量观察指标。研究结果1．BCG接种后对各组BALF中自细胞总数、Eos的影响1．1模型组与阴性对照组比较，BALF中白细胞总数、Eos比例及绝对值均明显升高(P＜0.01)；1．2 BCG接种各组与模型组比较均能明显降低BALF中白细胞总数、Eos比例及绝对值(P＜0.01)，接种各组间无显著差异(P＞0.05)。2．BCG接种后对哮喘小鼠气道、肺组织炎症的影响2．1病理学HE染色发现：阴性对照组小鼠气道、血管周围及肺实质几乎无炎性细胞及Eos浸润，上皮完整；而哮喘模型组小鼠气道、血管周围均可见大量炎性细胞和Eos浸润，并波及到肺实质，上皮脱落不完整。BCG接种后，气道及血管周围仍可见较多炎性细胞，Eos较模型组明显降低，上皮也基本完整。2．2各组小鼠气道黏液的组织学改变PAS染色发现：阴性对照组气道未见黏液形成，未见GCH／M。模型组小鼠气道可见气道上皮GC增生肥大，并有大量黏液形成。而BCG接种组中B1组、B2组气道上皮GC不仅数量显著下降，而其体积也显著下降，黏液形成显著减少。2．3气道黏液定量分析结果2．3．1模型组与阴性对照组相比，模型组储备指数、化生指数均显著升高(P＜0.01，P＜0.05)；2．3．2 BCG接种后，各组储备指数较模型组均明显下降(P＜0.01)，B2组较A1组、A2组更明显地降低了储备指数(P＜0.05)；2．3．3 BCG接种组中，只有B1组、B2组能抑制化生指数(P＜0.05)，而A1组、A2组未见抑制效应(P＞0.05)。3．BCG接种后对BALF、外周血中IL-5浓度的影响3．1模型组BALF和PB中IL-5浓度较阴性对照组均明显升高(P＜0.01)；3．2 BCG接种各组与模型组比较，除A组外，BALF中IL-5浓度均降低(P＜0.01)，而B2组较A1组、A2组更明显地降低了BALF中IL-5浓度(P＜0.01，P＜0.05)；3．3 B1组、B2组与模型组相比明显降低了PB中IL-5浓度(P＜0.05)，A1组、A2组未降低(P＞0.05)。4．BCG接种后对BALF、外周血中IFN-γ浓度的影响4．1模型组BALF和PB中IFN-γ浓度与阴性对照组比较均无差异(P＞0.05)；4．2 BCG接种各组中只有B2组BALF中IFN-γ浓度升高与模型组相比有显著差异(P＜0.01)，B2组较A1组也升高(P＜0.01)；4．3外周血IFN-γ浓度仅B1组、B2组升高较模型组有显著差异(P＜0.05，P＜0.01)，B2组较A1组也升高(P＜0.05)。5．BCG接种后BALF、外周血中IL-5／IFN-γ比值的变化5．1 BCG接种后BALF中IL-5／IFN-γ比值的变化BCG接种各组与模型组比较，除A1组外BLAF中IL-5／IFN-γ比值均下降，B2组差异更显著(P＜0.01)；B2组与A1组、A2组比较，IL-5／IFN-γ比值下降，差异有显著性(P＜0.01)；B1组较A1组下降(P＜0.05)，A2组较A1组比值也下降(P＜0.01)。5．2 BCG接种后外周血中IL-5／IFN-γ比值的变化模型组较阴性对照组IL-5／IFN-γ比值明显升高(P＜0.01)；BCG接种各组较模型组均下降，均有显著差异(A1组P＜0.05，其他各组P＜0.01)，各组间未见差异(P＞0.05)。结论1．致敏前及致敏时腹腔接种BCG均可抑制哮喘小鼠BALF中Eos水平，抑制炎症细胞尤其是Eos的气道、肺组织浸润；致敏时较致敏前接种BCG可明显抑制哮喘小鼠气道黏液的形成。2．致敏时接种BCG较致敏前接种能更有效抑制哮喘小鼠气道炎症，并且存在一定量效关系。3．致敏时接种对气道炎症抑制作用的增强可能与纠正Th1／Th2失衡有关。