不同发育时期小鼠睾丸引带ERα、ERβ、GPER表达的研究

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目的:  睾丸引带是影响睾丸下降的重要因素。在不同发育时期,睾丸引带变化不同,包括生长、增大、退化、收缩等,这些变化与胚胎期睾丸的发育和下降密切相关。睾丸的发育和下降不全影响睾丸的功能,并进而直接影响雄性生殖系统的发育。近年来研究表明,外源性雌激素可引起雄性生殖系统发育异常增加。在有关的机理方面,已有研究发现经典的雌激素受体(ERα和ERβ)可以不同程度地表达于睾丸引带组织,此外,也发现新型雌激素受体--G蛋白偶联的雌激素膜受体(GPER/GPR30)也表达于睾丸、膀胱、输精管等男性泌尿生殖器官。提示雌激素有可能通过多种受体途径影响男性泌尿生殖系统的发育。雌激素(包括外源性雌激素)与男性生殖系统发育异常的相关关系及机理目前备受关注,其中,外源性雌激素对睾丸引带的影响还很少研究。本实验通过免疫组织化学,免疫电镜,western blot等多种方法对不同发育时期小鼠睾丸引带中的上述三种雌激素受体进行了定性、定位和定量的研究。以期了解三种雌激素受体在睾丸引带中的表达,为后续研究雌激素通过睾丸引带途径影响小鼠生殖系统发育的机理奠定基础。  材料和方法:  昆明小鼠90只,按雌雄比例2:1合笼交配,以出现阴道栓作为受孕标志,发现阴栓当天定为妊娠0天,记为GD0(gestation day,GD),胎鼠组分别于GD17、GD19时取材。孕雌鼠待其自然分娩,以幼鼠出生当天记为生后0天,计为PD0(postnatal day,PD)。分别于PD0、PD3、PD7、PD14、PD21时取材。  分析不同发育时期(胎龄17天、19天,生后0天、3天、7天、14天、21天)小鼠睾丸引带中雌激素受体(ERα、ERβ、GPER)的表达情况:  1.取上述不同发育时期的小鼠睾丸引带,利用免疫组织化学检测睾丸引带上三种雌激素受体的表达情况。  2.取3天小鼠睾丸引带,利用免疫电镜技术对三种雌激素受体进行定位,了解其表达情况。  3.取上述不同发育时期的小鼠睾丸引带,利用蛋白质印迹方法了解三种雌激素受体的表达情况(定量)。  结果:  1.免疫组织化学观察:各个时间点的小鼠睾丸引带上ERα、ERβ及GPER阳性细胞均呈棕黄色或棕褐色,主要表达在睾丸引带内层疏松的间叶组织区内,外周较致密的细胞区内弱表达或不表达。  2.免疫组织化学染色:随着小鼠天龄的增加,可见各组ERα及GPER的阳性染色细胞均为生后3天小鼠睾丸引带最高,但GPER的阳性染色细胞较ERα明显弱且少;ERβ阳性染色细胞为生后0天最高。统计学分析结果:①ERα表达分析:生后0天、3天两两相比无统计学意义(P>0.05),余各发育阶段组两两相比有统计学意义(P<0.05)。②ERβ表达分析:孕17天与孕19天两两相比有统计学意义(P<0.05),及生后0天与各组两两相比有统计学意义(P<0.05),余各发育阶段之间无统计学意义(P>0.05)。③GPER表达分析:孕17天、孕19天、生后7天、生后14天、生后21天与各组之间相比均有统计学意义(P<0.05);生后0天、3天两两相比无统计学意义(P>0.05)。  3.免疫电镜观察:①ERα:细胞核可见散在的胶体金颗粒标记。②ERβ:细胞核和细胞质可见少量胶体金颗粒标记。③GPER:细胞质内偶见个别胶体金颗粒标记。  4.Western blot检测:随着小鼠天龄的增加,均检测到ERα、ERβ及GPER的表达,各组目的蛋白表达均不一致。经统计学分析:①ERα的表达量:胎龄时期(孕17天、孕19天)两两比较差异无统计学意义(p>0.05);生后0天、生后3天两两比较差异无统计学意义(p>0.05);其余各组之间相互比较差异均有统计学意义(p<0.05)。②ERβ的表达量:孕19天、生后0天、生后3天两两比较差异存在统计学意义(p<0.05),其余各组之间差异无统计学意义(p>0.05)。③GPER的表达量:孕17天、孕19天与生后各组之间比较均有差异(p<0.05);生后3天与各组比较差异均有统计学意义(p<0.05);生后7天、14天、21天与生后各组(生后3天、7天、14天、21天)比较差异均有统计意义(p<0.05),其余各组之间无统计学意义(p>0.05)。  结论:  1.正常小鼠睾丸引带组织中,各个发育阶段均有ERα、ERβ及GPER表达,但表达的位置及含量均不一致。  2.正常小鼠睾丸引带组织中,ERα、ERβ及GPER主要存在于睾丸引带内层疏松间叶组织区,外周致密区表达弱或不表达。  3.随着小鼠天龄的增加,小鼠睾丸引带组织中的ERα主要表达于细胞核中,睾丸下降第一阶段较第二阶段前表达逐渐增加,第二阶段后表达逐渐减弱。  4.随着小鼠天龄的增加,小鼠睾丸引带组织中的ERβ表达于细胞核和细胞质中,在睾丸下降的第一阶段其表达逐渐增加,第二阶段也有表达但无差异性(其蛋白定量研究尚需进一步确定)。  5.随着小鼠天龄的增加,小鼠睾丸引带组织中的GPER主要表达于细胞膜及细胞质。睾丸下降第一阶段表达量逐渐增加,第二阶段逐渐减弱。  综上,本实验研究提示不同发育时期的小鼠睾丸引带组织均有ERα、ERβ及GPER的不同程度表达。根据睾丸下降的不同阶段,这三种受体的表达有一定的规律性。
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