肠黏膜屏障由黏膜上皮细胞、肠道正常微生物群等环节组成,不仅能保障营养物质的高效吸收,而且可通过不断更新脱落的肠上皮以阻挡外界环境。肠黏膜依靠肠道隐窝处的干细胞持续增殖和分化来替代损伤脱落的肠上皮以维持肠道稳态。然而肠上皮不断受到微生物的刺激,打破肠道稳态,诱发肠道炎症。沙门氏菌是养殖业中最常见的致病菌群之一,导致严重腹泻的肠道炎症,给养殖业带来巨大的经济损失。随着益生菌的研究和应用不断深入,越来越多的研究者证实乳酸杆菌能有效抵抗病原菌的入侵和感染。然而,由于复杂的体内环境,以及缺乏适宜的研究模型,故乳酸杆菌抵抗病原菌维护肠上皮屏障完整的机制尚未明确,为了明确这一机制,本次试验通过肠类器官模型并结合动物试验,探讨嗜酸乳杆菌调控Wnt/β-catenin途径修复沙门氏菌损伤的黏膜屏障机理。本研究首先分组为空白对照组、嗜酸乳杆菌ATCC4356组和嗜酸乳杆菌保护组,然后利用沙门氏菌SL1344成功构造了肠炎模型。实验研究的内容主要有以下三个部分:1嗜酸乳杆菌调控wnt/β-catenin稳定肠上皮细胞的增殖减缓肠黏膜损伤嗜酸乳杆菌在肠道免疫和对病原菌的拮抗作用中起着日益重要的作用。为了探究嗜酸乳杆菌对病原菌引起的肠黏膜损伤的修复作用,本次试验选用四周龄的C57BL/6小鼠为研究对象,连续饲喂嗜酸乳杆菌(1×108CFU)一个月后,感染沙门氏菌(1×107CFU)发现沙门氏菌引起小鼠严重死亡,肠道组织形态(HE)损伤,肠绒毛出血,萎缩,肠隐窝增生PCNA+(干细胞过渡增殖区域)。免疫英光检测了小鼠肠道分泌型细胞(潘式细胞UEA-1+、杯状细胞Lysozyme+、tuft细胞DCLK1+)的数量,结果发现:沙门氏菌入侵感染小鼠肠道,肠上皮的分泌型细胞扩增。而嗜酸乳杆菌保护组的小鼠感染沙门氏菌后的各项指标:存活率、肠道组织病理形态、隐窝病理增生,分泌型细胞扩增都显著改善。肠上皮的增殖和分化的动力来源于隐窝处的干细胞,试验利用qPCR检测干细胞的mRNA水平,结果显示:相较于嗜酸乳杆菌保护组,单独沙门氏菌感染组的干细胞数量急剧减少,以及wnt/β-catenin信号通路的转录基因Axin2异常增高。为了进一步探究嗜酸乳杆菌对沙门氏菌感染小鼠的保护作用,通过ELISA检测发现嗜酸乳杆菌能降低肠道的炎症因子(IL-1β和TNF-α)和肠道菌载量;并发现嗜酸乳杆菌阻止沙门氏菌入侵从而减缓炎症的侵袭。TLRs是模式识别受体,首先识别病原相关分子模式(PAMPs),调节肠道的炎症反应,因此它们作为机体防御机制的重要部分。为了验证TLR在嗜酸乳杆菌的调控中的作用,试验利用荧光定量PCR检测肠道TLR表达量的变化,发现嗜酸乳杆菌能缓解沙门氏菌诱导LTR2和TLR4的高表达,调控肠道炎症,减缓沙门氏菌诱发的炎症侵袭,从而减缓隐窝处的病理增生,最终逆转干细胞(Lgr5)数量降低的命运。以上结果证明嗜酸乳杆菌能调控受损的肠道微环境,调节小鼠肠道干细胞数量和TA区的增殖速率,维持肠道更新节奏,保证细胞自身正常的调控机制。2建立嗜酸乳杆菌-肠类器官-沙门氏菌的体外共培养模型肠类器官模型是一种三维细胞培养系统,可以在体外稳定培养形成具有隐窝-绒毛结构与体内来源的肠道组织结构高度相似。肠类器官具有肠干细胞,可以复制分化不同的细胞类型:吸收型细胞、分泌型细胞,并在基质胶的支持下有利于肠类器官空间的延展和长期培养。本试验使用EDTA分离小鼠肠道隐窝,肠隐窝是小肠干细胞的栖息地。在原代的培养过程中,我们将获取的细胞培养在一个支持介质(基质胶Matrigel)上,使其能够维持三维生长。为了肠类器官后期的长期培养和稳定传代,细胞的生长培养基中添加了 500 ng/ml R-spondin,100 ng/ml Noggin 和 50 ng/mLEGF,提供干细胞在体内微环境所需要的信号和刺激。本试验利用含有绒毛结构的成熟肠类器官探究嗜酸乳杆菌抵抗病原菌感染的机制。首先分离和培养肠类器官,其次建立嗜酸乳杆菌-肠类器官-沙门氏菌的共培养体系:预先在上清中加入嗜酸乳杆菌ATCC4356(1×108CFU)孵育12h。随后打散隐窝细胞团,加入沙门氏菌SL1344(1×107CFU)并感染1h使其充分入侵细胞的游离部分,1h后重新将细胞与基质胶混合并铺板与24孔中培养24h。结果发现沙门氏菌感染的肠类器官的成芽率降低,中间黑色阴影面积增大,表明细胞的死亡,而嗜酸乳杆菌保护组的肠类器官形态显著改善,成芽率提高和阴影面积降低。这是首次建立嗜酸乳杆菌-肠类器官-沙门氏菌体外模型。3嗜酸乳杆菌调控wnt/β-catenin信号通路稳定细胞的增殖减缓肠类器官的损伤为了进一步证实体内的结果,本试验利用肠类器官的模型,模拟体内复杂的环境,将沙门氏菌感染小鼠肠类器官1h后,将感染后的细胞重新用基质胶铺板,培养24h。在不同时间点在光镜下观察发现:沙门氏菌感染小鼠肠类器官引起其发芽率和形成率大大降低,诱导肠道类器官发生增生(EdU)。为了应对病原菌的入侵,肠类器官分化一定数量的杯状细胞和潘氏细胞,这些分泌型细胞能产生抗菌肽等物质并产生高浓度炎症因子。细胞的组成和分化的变化影响到肠道的稳态,肠道干细胞标志物Lgr5的表达量显著降低,Axin2和Wnt3基因异常高表达,诱发肠道不可逆的损伤。然而,通过嗜酸乳杆菌预处理,沙门氏菌感染的小鼠肠类器官的发芽率和形成率都提高了,而且病原菌引起的炎症因子水平(TNF-α)得以缓解。嗜酸乳杆菌也能引起一定水平的分泌型细胞来防御病原菌,但同时能调控细胞的分化水平,稳定细胞的正常的增殖水平和保证细胞自身正常的调控机制。本研究利用荧光定量PCR检测了 TLR2和TLR4以及下游的MyD88的信号,结果显示:沙门氏菌感染组TLR4和TLR2和MyD88的表达显著高于健康对照组。与感染组组比较,嗜酸乳杆菌保护组显示TLR4和TLR2mRNA表达水平显著降低。该结果与体内结果一致,共同阐明益生菌保持上皮稳态的机制可能与TLR的表达有关,通过阻止沙门氏菌利用TLR从而减缓肠炎引发的肠隐窝过度增殖,稳定肠道稳态。