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研究背景与目的人脑胶质瘤(glioma)是中枢神经系统中最为常见的原发肿瘤之一,很少有药物可以克服血脑屏障进行有效治疗,因此具有很高的致死率和复发率。此外,组织学的研究发现,胶质瘤可通过高表达血管内皮生长因子及相关受体驱动新生血管的大量生成,这为肿瘤进一步发展提供了重要的营养供应。因此,靶向肿瘤部位新生血管的疗法已经成为针对脑胶质瘤的新型治疗方案之一,具有极大的开发潜力。神经纤毛蛋白1(neuropilin1,NRP1)作为VEGFA-165的共受体起到了增强VEGFR2信号通路的作用,现已被认为是一个新型的抗血管生成治疗靶点。本论文的研究目的是设计开发一种细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)和NRP1靶向肽融合的新型双功能穿膜靶向肽,通过体内外抗血管生成活性评价和潜在作用机制的探究,评估其高效穿透血脑屏障和抑制胶质瘤血管生成的能力。实验方法1.体外筛选具有较强抗血管生成活性的NRP1靶向肽。前期通过查阅文献资料选定了 6个可能具备一定抗血管生成活性的候选NRP1靶向肽。首先采用MTT方法检测6个候选NRP1靶向肽对HUVEC细胞增殖的影响,以及微管形成实验观察6个候选NRP1靶向肽能否在血管生成刺激因子VEGFA-165存在的条件下抑制HUVEC细胞的微管形成,结合两个实验结果筛选出抗血管生成活性最强的NRP1靶向肽,用于后续实验。2.利用两种不同linker氨基酸将细胞穿膜肽Tat与筛选出的NRP1靶向肽共价连接成融合肽,比较其体外抗血管生成活性。采用MTT方法比较两种融合肽对HUVEC细胞增殖的影响,以及微管形成实验观察两种融合肽对HUVEC细胞微管形成的影响。同时,进一步比较两种融合肽对HUVEC细胞迁移的影响。3.检测NRP1靶向肽、细胞穿膜肽Tat和融合肽对NRP1蛋白的亲和能力。将NRP1蛋白偶联于CM5芯片上,采用表面等离子共振(SPR)的方法获取不同多肽对NRP1蛋白的亲和解离常数。4.评价融合肽的体外抗血管生成活性。采用MTT方法检测上述实验筛选出的融合肽的抗HUVEC细胞增殖活性,微管形成实验检测融合肽的抗HUVEC细胞微管形成活性,划痕实验和Transwell小室实验检测融合肽的抗HUVEC细胞迁移活性。利用Hoechst细胞核染色方法和Annexin V-FITC/PI双染法检测融合肽的促HUVEC细胞凋亡活性。5.探讨融合肽体外抗血管生成活性的分子机制。通过Western blotting方法,检测融合肽对HUVEC细胞中VEGFR2相关信号通路关键蛋白磷酸化水平的影响。6.检测脑微血管内皮细胞bEnd.3对融合肽的摄取情况。利用荧光显微镜和流式细胞术,分别定性和定量检测脑微血管内皮细胞bEnd.3对FITC标记融合肽的摄取。7.检测融合肽的体内脑分布情况。将胶质瘤U87-luc-mCherry细胞接种到裸鼠脑部,构建裸鼠原位脑胶质瘤模型。制作脑组织冰冻切片并进行荧光扫描,观察FITC标记融合肽能否通过尾静脉注射的方式穿透血脑屏障并在脑部肿瘤区域积累。8.检测融合肽对体内脑胶质瘤的生长抑制作用。构建裸鼠原位脑胶质瘤模型,利用小动物活体成像系统监测融合肽在给药期间对胶质瘤生长的抑制作用;每日记录裸鼠体重的变化,判断不同多肽的治疗有无明显毒性;多肽治疗结束后利用HE染色实验对脑组织切片进行染色,进一步观察脑部肿瘤的大小;采用CD31免疫荧光实验对脑组织切片进行染色,观察不同多肽治疗组裸鼠肿瘤组织血管生成情况。实验结果1.NRP1靶向肽RP7具有较好的体外抗血管生成活性。MTT实验结果显示,6个候选NRP1靶向肽对HUVEC细胞均无明显的增殖抑制活性。体外微管形成实验结果表明,序列为RPARPAR(简称:RP7)的NRP1靶向肽表现出了明显抗HUVEC细胞微管形成的能力。故选择RP7作为本论文的NRP1靶向肽进行后续实验。2.融合了半胱氨酸(C)为linker氨基酸的融合肽Tat-C-RP7具有更强的体外抗血管生成活性。MTT实验和体外微管形成实验结果表明,linker氨基酸为半胱氨酸或甘氨酸的融合肽Tat-GG-RP7和Tat-C-RP7具有相似的抗HUVEC细胞增殖活性和抗HUVEC细胞微管形成能力。然而划痕实验结果显示,linker为半胱氨酸的融合肽Tat-C-RP7还具有抗HUVEC细胞迁移的活性。3.融合肽Tat-C-RP7对NRP1蛋白具有最强的亲和力。亲和力检测结果表明,与NRP1靶向肽RP7和细胞穿膜肽Tat相比,融合肽Tat-C-RP7对NRP1蛋白具有最强的亲和力,KD=69.7 nM。4.融合肽Tat-C-RP7具有显著的体外抗血管生成活性。MTT实验结果表明,融合肽Tat-C-RP7可明显抑制HUVEC细胞的增殖;体外微管形成实验结果表明,在刺激因子VEGFA-165存在的情况下,融合肽Tat-C-RP7可明显减少HUVEC细胞的微管形成;划痕实验和Transwell实验结果表明,融合肽Tat-C-RP7可明显抑制HUVEC细胞的迁移能力;Hoechst细胞核染色和Annexin V-FITC/PI双染法结果显示,融合肽Tat-C-RP7可明显促进HUVEC细胞发生凋亡。5.融合肽Tat-C-RP7通过下调VEGFR2相关信号通路中VEGFR2、PLCγ、ERK1/2和AKT蛋白的磷酸化水平,发挥体外抗血管生成作用。在有无刺激因子VEGFA-165存在的条件下,融合肽Tat-C-RP7均可抑制HUVEC细胞内VEGFR2、PLCγ、ERK1/2和AKT蛋白的磷酸化水平,但对HUVEC细胞内FAK、P38 MAPK,SRC蛋白的磷酸化水平没有明显影响。6.脑微血管内皮细胞bEnd.3对融合肽Tat-C-RP7具有最强的摄取能力。荧光显微镜和流式细胞术的结果表明,脑微血管内皮细胞bEnd.3对FITC标记的NRP1靶向肽RP7、细胞穿膜肽Tat,融合肽Tat-C-RP7均有一定摄取,但对融合肽Tat-C-RP7的摄取最多。7.融合肽Tat-C-RP7在体内具有穿透血脑屏障并在胶质瘤部位积累的能力。脑组织冰冻切片的荧光扫描结果说明,FITC标记的融合肽Tat-C-RP7能够穿透血脑屏障并明显积累在肿瘤部位。8.融合肽Tat-C-RP7可抑制裸鼠体内脑胶质瘤的生长。小动物活体成像和脑组织HE染色结果证实,融合肽Tat-C-RP7对原位脑胶质瘤具有明显的生长抑制作用,并对裸鼠体重没有明显影响。脑组织CD31免疫荧光染色实验结果表明,融合肽Tat-C-RP7对肿瘤部位的血管形成有明显抑制作用。实验结论通过细胞体外实验筛选出了活性最好的融合肽Tat-C-RP7,其具有较强的体内外抗血管生成活性和穿透血脑屏障的能力。该融合肽与NRP1靶向肽RP7和细胞穿膜肽Tat相比,对NRP1蛋白的亲和力更强。进一步阐明其分子机制,融合肽Tat-C-RP7的体外抗血管生成活性可能是通过下调HUVEC细胞内VEGFR2相关信号通路中VEGFR2及下游PLCγ、ERK1/2,AKT蛋白的磷酸化水平实现的。研究意义基于新型抗血管生成治疗靶点辅助受体NRP1及活性分子难以穿透血脑屏障的现实困境,本论文成功设计和筛选出了一个具有抑制肿瘤血管生成和穿透血脑屏障双功能的穿膜靶向肽Tat-C-RP7,这为今后细胞穿膜肽和NRP1靶向肽的应用提供了新思路,更为脑胶质瘤的抗血管生成疗法提供了研究基础。