由病毒感染、肝毒素、酒精摄入或药物引起的肝损伤已成为世界范围内严重的人类健康问题,其发病率不断上升。目前,除了肝移植治疗急性肝衰竭和终末期慢性肝损伤外,没有有效的治疗方法。然而,由于供体组织的来源有限且成本高昂,严重限制了通过肝移植进行的治疗。因此,迫切需要探索新的有效的预防和治疗策略。过量服用对乙酰氨基酚(4’羟基乙酰苯胺,扑热息痛,APAP)已成为药物引起的急性肝衰竭的最常见原因。APAP诱导急性肝损伤(APAP-induced liver injury,AILI)的研究显示,血管生成和氧化还原稳态在肝保护和修复中起着重要作用。低氧诱导因子-1(HIF-1)是一种转录因子,在调节血管生成、氧化还原稳态和能量平衡相关基因的表达中发挥关键的调节作用。在包括急性肝损伤在内的急性组织损伤过程中,HIF-1作为急性低氧应激最敏感的因子,它的上调是促进血管生成和组织损伤修复的关键。HIF-α上的脯氨酸残基可以被细胞内的脯氨酰羟化酶(PHDs)羟化,羟化后的HIF-α通过泛素-蛋白酶体途径降解,因此,PHD是调节细胞中HIF-α稳定性的限速酶。其中PHD2是催化HIF-1α脯氨酸羟化的关键限速酶。研究表明,抑制PHD2的活性导致HIF-1α的稳定,从而增强了HIF-1下游大量靶基因的诱导,这些基因调节广泛的低氧反应,如血管生成,能量补偿,氧化还原,pH稳态以及许多其他过程,最终改善急慢性低氧时组织损伤。因此,PHD2已成为促进血管生成和组织损伤修复的一个潜在靶点。鉴于目前PHDs抑制剂缺乏特异性和靶向性,会产生大量的毒副作用,因此如何获得高效特异抑制PHD2活性的抑制剂备受关注。由于抗体具有高特异性和高亲和性作用特点,近年来备受关注。随着抗体工程技术的发展,派生出来的胞内抗体技术,通过对抗体分子的适当修饰,实现细胞内重要靶分子的表型敲除。为此,本研究利用胞内抗体技术制备了一种在细胞内靶向失活PHD2的胞内单链抗体,并对其生物学活性和在APAP肝损伤中的作用进行研究。课题组前期研究中纯化了人源PHD2蛋白,以此蛋白为抗原,通过噬菌体库筛选的方法获得了抗PHD2单链抗体(scFv),并且通过可溶性表达、纯化及ELISA分析,发现此scFv能够特异性结合重组PHD2。本研究为了靶向失活细胞内的PHD2,以抗PHD2的scFv基因为模板,用内质网(ER)滞留信号序列修饰,从而制备了内质网滞留型的抗PHD2胞内抗体(ER-INP),检测此胞内抗体是否会在细胞中成功表达,并对其活性进行表征,然后探讨了ER-INP在小鼠APAP诱导的急性肝损伤中的作用和可能的机制。取得如下结果:一、成功构建了内质网滞留型的抗PHD2胞内抗体(ER-INP)。以抗PHD2人源单链抗体scFv基因为模板,通过PCR引入滞留于内质网的细胞内定位信号和E-tag序列,成功制备内质网滞留型抗PHD2胞内抗体基因ER-INP,并将其克隆入真核表达载体中构建重组人ER-INP真核表达载体pER-INP。将pER-INP转染进细胞中,RT-PCR、免疫荧光和Western blot实验分析结果表明,引入内质网定位信号和E-tag序列的抗PHD2胞内抗体基因能够在细胞中有效表达和实现目标蛋白的内质网定位。二、抗PHD2胞内抗体特异性结合细胞内PHD2并抑制其脯氨酰羟化酶活性。将pER-INP转染进细胞中,免疫共沉淀实验、Western blot和免疫荧光实验分析抗PHD2胞内抗体的作用效能。结果表明,细胞内表达的抗PHD2胞内抗体ER-INP能够识别并结合细胞内的PHD2蛋白,抑制PHD2脯氨酰羟化酶活性,即抑制其羟化HIF-1α的Pro564和Pro402的活性,明显上调HIF-1α的蛋白水平。三、抗PHD2胞内抗体在体外和体内均显示出明显的促血管生成活性。为了检测ER-INP在体外和体内是否具有促血管生成活性,分别采用划痕实验检测人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移能力,3D培养模型来检测HUVEC的成管能力,利用鸡胚绒毛尿囊膜(CAMs)模型来检测其体内血管生成情况。通过实时定量PCR、Western blot和ELISA等实验方法分析HIF-1下游促血管生成相关靶基因的表达。实验结果表明ER-INP的表达显著促进了HUVEC的迁移和管状形成能力,并增强了鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成能力。此外,实时定量PCR检测结果表明ER-INP促进了HIF-1下游促血管生成相关靶基因VEGF、ANGPTL-2、MMP-2和MMP-13等的表达,而且Western blot和ELISA结果表明ER-INP显著提高VEGF、MMP-2和MMP-13等促血管生成因子的蛋白水平。四、抗PHD2胞内抗体保护APAP诱导的急性肝损伤。将带有GFP的对照质粒尾静脉注射入小鼠体内,发现从注射后的第1天到第3天可以检测到该蛋白的表达,第3天在肝脏中的表达达到最高水平,由此推测该表达载体携带的ER-INP基因尾静脉注射入小鼠体内后可能主要在肝脏中表达,并在第3天达到最高水平;和对照组相比,正常小鼠尾静脉注射表达ER-INP的质粒不影响肝脏的组织形态学以及小鼠血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)水平,总之ER-INP不损害小鼠肝脏,并且ER-INP可以在小鼠肝脏中成功表达;小鼠腹腔注射250 mg/kg剂量的APAP溶液,于注射后24 h,48 h和72 h处死小鼠,发现24 h达到肝损伤的高峰期,表现为ALT和AST水平显著升高以及肝脏小叶中央区出现明显的坏死,而尾静脉注射表达靶向PHD2胞内抗体ER-INP质粒预处理48 h后再给予APAP,可显著抑制APAP引起的血清ALT和AST的升高以及肝小叶中央区的坏死也明显改善。五、ER-INP对APAP诱导急性肝损伤的保护作用机制。一方面,ER-INP预处理的APAP肝损伤小鼠肝组织出现了明显促血管生成效应,表现为免疫组化结果显示肝脏中血管新生标志分子CD31表达明显上调,同时具有促血管生成作用的HIF-1α水平显著上调,Western blot和ELISA结果显示HIF-1下游与血管生成密切相关的VEGF和MMP-2的蛋白表达水平明显上调,实时定量PCR结果显示HIF-1下游与血管生成密切相关的VEGF、ANGPTL-2和MMP-2的基因转录水平明显上调;另一方面,ER-INP预处理有利于维持APAP肝损伤小鼠肝组织的氧化还原稳态,表现为ER-INP预处理显著抑制肝脏氧化应激标志分子丙二醛(malondialdehyde,MDA)的水平,Western blot结果显示ER-INP预处理显著抑制了内质网应激标志分子葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein 78,GRP78)水平的升高,然而显著增强抗氧化酶即过氧化物氧化还原酶4(peroxiredoxin 4,PRDX4)的活性和显著抑制抗氧化分子即谷胱甘肽(L-glutathione,GSH)的消耗。总之,ER-INP可能通过促进血管生成和维持氧化还原稳态来保护APAP诱导的急性肝损伤。综上所述,成功制备在细胞内特异性结合PHD2的胞内抗体ER-INP,靶向PHD2的胞内抗体能够在体内外抑制PHD2活性,提高HIF-1α的稳定性,促进HIF-1下游靶基因的转录激活,可能通过促进血管生成和维持氧化还原稳态来保护APAP诱导的肝损伤,这为组织损伤和局部缺血性疾病的临床治疗开辟了新途径,为新药研发提供了新思路和实验依据。