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目的:以转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的A549细胞发生上皮间充质转化(EMT)模型,筛选具有体外抑制EMT的中药活性物质,并基于细胞自噬相关基因表达和自噬活性变化,探讨治疗特发性肺纤维化(IPF)的潜在作用机制。
方法:1.实验研究:利用TGF-β1诱导A549细胞发生EMT的IPF体外细胞模型,分别给予黄芩苷、青蒿琥酯、大黄素、卷柏提取物(醇提物、水提醇沉物)、苦参碱、氧化苦参碱、槲皮素、姜黄素、葎草醇提取物(干品、鲜品)、迷迭香酸、川穹嗪、芦丁、黄芩素、木犀草素及甘草酸干预,采用qRT-PCR法检测胶原蛋白Ⅰ(ColⅠ)、EMT标志物(Vimentin、E-cadherin)基因以及自噬标志物(ATGs)基因mRNA表达变化,筛选抗IPF的自噬相关机制的中药活性物质。
2.倒置相差显微镜下观察筛选出的具有抑制EMT的中药活性物质对TGF-β1诱导的A549细胞形态学的影响;进一步利用WB法、细胞自噬流,检测自噬表达差异,来探讨中药活性物质通过细胞自噬抑制IPF体外模型的作用机制。
结果:1.模型组细胞类型标志物基因表达结果和镜下观察形态学微观指标,符合EMT变化,同时自噬基因(maker)表达下降。TGF-β1诱导A549上皮间质转化且自噬降低的最佳作用浓度是10ng?mL-1,作用时间是48h。
2.与模型组相比,应用18种中药单体和中药提取物后,ColⅠ指标都有不同程度降低,其中以黄芩苷、青蒿琥酯、大黄素、干品葎草醇提物、木犀草素、槲皮素抑制ColⅠ表达效果较好,同时Vimentin表达也发生了同向变化;黄芩苷和大黄素干预自噬基因ATGs mRNA水平最为显著。
3.倒置相差显微镜下形态学观察结果显示黄芩苷抑制TGF-β1诱导A549细胞发生EMT,使大多数细胞维持上皮细胞形态;相对于模型组,qRT-PCR、WB法结果表明黄芩苷组、大黄素组自噬相关基因ATGs mRNA和自噬蛋白表达上调,ColⅠ、Vimentin mRNA表达下调,且大黄素组变化幅度大于黄芩苷组;自噬流实验验证了模型组自噬流被抑制,黄芩苷和大黄素能够提高细胞自噬活性。
结论:基于EMT的细胞自噬,以TGF-β1诱导A549细胞发生EMT,qRT-PCR法检测ColⅠ、EMT标志物和自噬相关基因表达等指标,是一种简单、高效、可行的筛选抗IPF且激活自噬的中药活性物质检测方法。本研究发现大黄素和黄芩苷能减少TGF-β1诱导A549的ColⅠ表达,Vimentin mRNA表达降低,抑制EMT过程,使自噬相关基因ATGs mRNA和蛋白表达升高,并提高细胞自噬活性。
方法:1.实验研究:利用TGF-β1诱导A549细胞发生EMT的IPF体外细胞模型,分别给予黄芩苷、青蒿琥酯、大黄素、卷柏提取物(醇提物、水提醇沉物)、苦参碱、氧化苦参碱、槲皮素、姜黄素、葎草醇提取物(干品、鲜品)、迷迭香酸、川穹嗪、芦丁、黄芩素、木犀草素及甘草酸干预,采用qRT-PCR法检测胶原蛋白Ⅰ(ColⅠ)、EMT标志物(Vimentin、E-cadherin)基因以及自噬标志物(ATGs)基因mRNA表达变化,筛选抗IPF的自噬相关机制的中药活性物质。
2.倒置相差显微镜下观察筛选出的具有抑制EMT的中药活性物质对TGF-β1诱导的A549细胞形态学的影响;进一步利用WB法、细胞自噬流,检测自噬表达差异,来探讨中药活性物质通过细胞自噬抑制IPF体外模型的作用机制。
结果:1.模型组细胞类型标志物基因表达结果和镜下观察形态学微观指标,符合EMT变化,同时自噬基因(maker)表达下降。TGF-β1诱导A549上皮间质转化且自噬降低的最佳作用浓度是10ng?mL-1,作用时间是48h。
2.与模型组相比,应用18种中药单体和中药提取物后,ColⅠ指标都有不同程度降低,其中以黄芩苷、青蒿琥酯、大黄素、干品葎草醇提物、木犀草素、槲皮素抑制ColⅠ表达效果较好,同时Vimentin表达也发生了同向变化;黄芩苷和大黄素干预自噬基因ATGs mRNA水平最为显著。
3.倒置相差显微镜下形态学观察结果显示黄芩苷抑制TGF-β1诱导A549细胞发生EMT,使大多数细胞维持上皮细胞形态;相对于模型组,qRT-PCR、WB法结果表明黄芩苷组、大黄素组自噬相关基因ATGs mRNA和自噬蛋白表达上调,ColⅠ、Vimentin mRNA表达下调,且大黄素组变化幅度大于黄芩苷组;自噬流实验验证了模型组自噬流被抑制,黄芩苷和大黄素能够提高细胞自噬活性。
结论:基于EMT的细胞自噬,以TGF-β1诱导A549细胞发生EMT,qRT-PCR法检测ColⅠ、EMT标志物和自噬相关基因表达等指标,是一种简单、高效、可行的筛选抗IPF且激活自噬的中药活性物质检测方法。本研究发现大黄素和黄芩苷能减少TGF-β1诱导A549的ColⅠ表达,Vimentin mRNA表达降低,抑制EMT过程,使自噬相关基因ATGs mRNA和蛋白表达升高,并提高细胞自噬活性。