木糖醇是一种五碳糖醇,具有抗龋齿、代谢不依赖胰岛素、改善肝功能等特点,广泛应用于食品、医药和化工等行业。当前工业上生产木糖醇主要是利用半纤维素水解液中分离纯化获得的纯木糖,在高温高压条件下使用镍催化加氢制得,这种工艺条件苛刻、容易造成污染、生产成本较高。生物法生产木糖醇不需要高温高压条件、污染环境的镍和高纯度木糖等,所以生物法生产木糖醇越来越受到人们的重视。大肠杆菌作为生产各种高附加值化学品的理想宿主,其具有培养条件简单、能够利用半纤维素水解液中所有糖类、生长速度快、基因操作简便、蛋白表达水平高等诸多优点。目前,以大肠杆菌为宿主利用半纤维素水解液生产木糖醇的研究已有报道,但其生产效率低且成本较高,和化学法相比还不具备优势。本论文以大肠杆菌W3110为宿主细胞,针对目前基因工程菌生产木糖醇存在的问题,主要围绕以下四个方面进行了研究：1)在较高温度下蛋白的高效可溶表达；2)目的基因在宿主菌中遗传稳定性；3)生产过程中副产物阿拉伯糖醇的消除；4)工业应用中培养基的廉价化。首先,为了解决在较高温度下蛋白可溶表达问题,我们基于质粒载体系统构建了第一代高产木糖醇菌株。利用质粒载体进行蛋白的表达,通过mRNA二级结构的调节,构建了一个能在较高温度下高效可溶表达的质粒；在30℃条件下,酶活是出发菌株的5.68倍。通过敲除葡萄糖磷酸转移酶系统中酶Ⅱ组分的ptsG基因,消除菌株的代谢物阻遏效应,使菌株能同时转运葡萄糖和木糖；敲除菌株自身代谢木糖的基因xylA和xylB,阻断木糖的代谢利用；敲除可转运木糖醇的果糖磷酸转移酶系统中酶Ⅱ组分的ptsF基因,减少木糖醇的磷酸化；通过一系列的优化,木糖醇生产效率是出发菌株的8.71倍。在实验室小试中,工程菌利用纯木糖进行补料分批发酵,产生了172.4 g L-1的木糖醇,生产效率为1.57 g L-1h-1,相对于葡萄糖的摩尔得率达到2.2；利用半纤维素水解液生产木糖醇时,产物浓度和生产效率分别达到150gL-1和1.40 gL-1h-1。接着,为了解决使用质粒系统带来的菌株遗传不稳定的问题,我们建立了一套基因组多拷贝整合系统RecA-assisted chromosomal integration (RACI),使xr基因以特定拷贝数整合进大肠杆菌的基因组；整个整合系统的核心是构建一个含有IS5序列、R6K复制子、P43启动子和xr基因的载体；利用IS5序列作为整合位点进行大肠杆菌基因组多拷贝整合,目的基因能在菌株内稳定遗传。利用该系统,我们构建了一株基因组中存在4个拷贝xr的菌株。工程菌利用纯木糖进行分批发酵时,产生了110.1 g L-1木糖醇,生产效率为3.06 g L-1h-1,此生产效率和使用多拷贝质粒菌株的生产效率大致相当,但其优点是不需要额外添加抗生素和诱导剂,降低了生产成本。进一步,为了解决木糖醇生产过程中副产物阿拉伯糖醇的问题,我们对木糖还原酶进行了定点突变,提高其对木糖的选择性,获得了一个对阿拉伯糖活性降低了27倍的突变体。在摇瓶发酵中,含有此突变体的菌株在使用质粒作为表达载体时,在产物中已检测不到阿拉伯糖醇的存在；但在发酵罐发酵中仍有47.34%的阿拉伯糖转化成阿拉伯糖醇。我们发现使用整合型菌株(木糖还原酶酶活较低),可以显著降低阿拉伯糖醇的产生,只有9.6%的阿拉伯糖转化成阿拉伯糖醇。使用含有突变酶的整合型菌株在发酵罐中转化半纤维素水解液生产木糖醇时,在产物中已检测不到阿拉伯糖醇。最后,为了使本工艺实现产业化,获得符合产业化需要的培养基组成,我们选择工业级玉米浆干粉作为氮源,工业级葡萄糖作为碳源,半纤维素水解液作为底物,对生产条件进行了优化。考察了温度对酶活和木糖醇生产效率的影响,确定了菌株在30℃条件下,木糖醇的生产效率最高；经过摇瓶水平的发酵条件优化,确定了最佳底物浓度为20g L-1,最佳底物添加时机为菌株培养4小时后添加。进行补料分批发酵时,工程菌产生了143.8 gL-1的木糖醇,生产效率为1.84gL-1h-1。总之,通过本论文的系统研究,实现了重组大肠杆菌利用廉价培养基转化半纤维素水解液生产高纯度木糖醇,为木糖醇的工业化生产奠定了坚实的基础。