论文部分内容阅读
本文利用RACE技术、整体原位杂交技术、实时荧光定量PCR技术和生物信息学技术等,以日本三角涡虫(Dugesia japonica)为研究材料,克隆了与创伤及再生相关基因的全长c DNA序列并对其进行了生物信息学分析,同时对这些基因的表达情况进行了系统研究,结果如下:1、利用RACE技术首次在日本三角涡虫中克隆了Dj Runt-1,Dj Runt-2和Djhn RNPA2B1三基因的全长c DNA序列,并根据三基因所推导的氨基酸序列用邻接法构建了系统进化树。Dj Runt-1基因c DNA全长为1029bp,包含一个969bp最大开放阅读框(ORF),编码一个由322个氨基酸残基组成的蛋白质;Dj Runt-2基因c DNA全长为765bp,包含一个576bp最大开放阅读框(ORF),编码一个由191个氨基酸残基组成的蛋白质;Djhn RNPA2B1基因c DNA全长为1142bp,包含一个825bp最大开放阅读框(ORF),编码一个由274个氨基酸残基组成的蛋白质。系统进化分析表明三基因在进化进程中非常保守。2、利用Ex PASy,TMHMM 2.0等在线软件对三基因所推导的氨基酸进行了生物信息学分析,结果表明:Dj Runt-1的分子量为37.55k Da,等电点9.59;Dj Runt-2的分子量为21.55k Da,等电点9.36,二者都含有“RD”结构域;Djhn RNPA2B1的分子量为31.4k Da,等电点8.35,含有一个“RBD”结构域。三者均是亲水性核蛋白,存在多个磷酸化位点,无信号肽且都不存在跨膜区。3、利用整体原位杂交和实时荧光定量PCR技术研究了Dj Runt-1,Dj Runt-2和Djhn RNPA2B1三基因在成体及切割再生过程中的时空表达模式。结果显示:Dj Runt-1基因在整体中广泛表达,在切割再生的胚基基部均有表达,而在再生的胚基部位没有表达;RT-PCR结果显示,Dj Runt-1基因在切割再生1和3天上调表达并在1天达到峰值。Dj Runt-2基因在整体中广泛表达,并且在切割再生的胚基及再生至5d后的胚基基部均有表达;RT-PCR结果显示,Dj Runt-2基因在切割后上调且在再生1天达到峰值,与Dj Runt-1基因呈现相似的表达趋势。结果提示:两基因在涡虫受损后可能促进创面修复及诱导干细胞的增殖和分化。Djhn RNPA2B1基因在性未成熟个体和性成熟个体身体两侧即精巢部位均有表达,在各再生阶段的胚基部位均有表达,其中,再生3、5天杂交信号最强。RT-PCR结果显示,Djhn RNPA2B1基因切割后0和5天上调表达并在0天达到峰值,结果提示Djhn RNPA2B1基因受创伤信号诱导调控细胞增殖和分化,同时Djhn RNPA2B1基因可能是一个多功能基因,在涡虫体内参与了生殖系统和神经系统的发育。