陈杨，昆虫体液免疫：肽聚糖识别蛋白及多酚氧化酶的研究，中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）．2010昆虫不具有获得性免疫，主要依赖于有效的天然免疫系统来抵御病原微生物的入侵。天然免疫包括细胞免疫和体液免疫两部分，细胞免疫指由血细胞介导的吞噬、节结形成和包囊等，体液免疫包括诱导抗菌肽产生的Toll和Imd两条信号通路，以及多酚氧化酶原(PPO)激活的级联反应。本论文两部分内容都是关于昆虫天然免疫，第一部分工作主要是利用家蚕全基因组芯片来检测家蚕幼虫对于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和PBS刺激的免疫反应。第二部分工作是在S2细胞中分别表达了果蝇的3个PPO，并发现它们具有非常不同的特性。通过同源建模及突变体的表达，找到了PPO特性不同的可能原因。以下是研究成果总结：　　 1．家蚕免疫诱导表达谱研究　　 作为鳞翅目昆虫的模式生物和重要的经济昆虫，家蚕为昆虫天然免疫尤其是体液免疫方面的研究作出了很大的贡献，在模式识别、信号转导、转录调控等方面已经鉴定出许多重要蛋白，但是关于家蚕免疫反应的分子机制还知之甚少。为了进一步了解家蚕免疫的分子机制，利用寡核苷酸芯片来检测家蚕脂肪体在虫体受到物理损伤和微生物刺激后的基因表达变化。　　 分别用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌粘质沙雷菌、真菌白僵菌和PBS注射5龄3天家蚕，6小时后取脂肪体样品。在检测的23000个基因中，465个基因在mRNA水平产生变化。其中，306个基因上调，159个基因下调。许多差异表达基因属于天然免疫基因，包括识别蛋白、信号转导、黑化、凝集和抗菌肽。另外，还有17％的差异表达基因编码未知蛋白。这些未知基因为进一步研究家蚕天然免疫提供了新的靶标。在这些差异表达基因中，有一个蛋白是保幼激素结合蛋白家族的成员，称为JHBP0303，它在损伤和微生物刺激后都高表达，对其可能在免疫中的作用进行了讨论。以PBS注射为对照，分析革兰氏阳性菌、阴性菌及真菌诱导的特异差异表达基因，发现既有相同基因也有不同的基因种类，体现了家蚕对于不同微生物有着不一样的免疫应答反应。　　 通过对家蚕免疫诱导表达谱的研究，加深了我们对家蚕天然免疫分子机制的认识，并为进一步的研究提供了新的靶标，也为将来认识如何通过提高家蚕的免疫力来减少家蚕疾病带来的损伤奠定了基础。　　 2．果蝇多酚氧化酶结构和活性研究　　 在第一部分家蚕免疫诱导基因表达谱的研究当中，发现prophenoloxidaseactivating enzyme（PPAE）基因在革兰氏阴性菌粘质沙雷菌诱导后上调表达。现有的研究表明，PPAE能够将PPO剪切成为PO，从而激活黑化反应。PPAE在细菌诱导后的上调表明PPO在家蚕天然免疫中起到重要的作用。近期也在蚊子中发现PPO诱导的黑化反应是蚊子杀死疟原虫的有效手段。为了进一步了解PPO的特性，以及为PPO功能的研究提供基础，我们以果蝇为模式，在S2细胞中表达了果蝇3个PPO。　　 发现，rPPO1和rPPO2需要额外的Cu2+才能有活性，但rPPO1和rPPO2对于Cu2+有着不同的反应速度。rPPO3表达后就有活性，加入Cu2+后会发生自激活。传统的观点认为PPO的激活是通过丝氨酸蛋白酶将PPO剪切成为来多酚氧化酶(PO)实现的，但rPPO3在自激活后并没有被酶剪切成为PO3，即rPPO3在酶原形式就有活性。通过同源建模及突变体的表达，发现活性位点口袋中的两个氨基酸和C-端的一段7个氨基酸的序列显著影响rPPO3的活性和自激活。并且rPPO1和rPPO3的活性都和活性位点口袋的大小呈正相关，但rPPO2却不同。　　 通过在S2细胞中表达果蝇的3个PPO，发现3个PPO具有不同的活性，并从结构方面找到了可能的原因，为深入研究PPO在天然免疫中的功能奠定基础。