论文部分内容阅读
苹果是重要的经济作物,种植范围广泛,经常会遭受干旱、高盐、低温等非生物胁迫,严重影响其生长发育和产量,因而提高苹果的抗逆性显得尤为重要。利用现代生物技术研究苹果的抗逆机制、挖掘抗逆基因,对苹果产量和品质具有十分重要的意义。在本实验室前期苹果转录组研究中,发现一个在逆境胁迫下表达显著上调的基因,编码一种植物特有的乳胶蛋白（Major Latex Protein,MLP）。为了深入研究该基因对非生物胁迫的响应,我们在原核细胞中诱导表达了该蛋白,研究了其对细胞抗逆功能的影响及发挥功能的位点;利用转基因技术在拟南芥中超表达该基因,研究在植物体中的抗逆作用。主要研究结果如下:（1）MdMLP423基因的生物信息学分析。本实验室前期苹果转录组研究中发现了一个盐胁迫诱导表达上调7倍的基因,该基因在GenBank中的注册号为LOC103448744,编码的蛋白质被命名为MdMLP423,属于乳胶蛋白。该基因定位于苹果第11号染色体,编码152个氨基酸残基。SignaIP和TMHMM软件分析发现,MdMLP423蛋白无信号肽也不存在跨膜区,属于水溶性胞质蛋白。基于拟南芥MLP（AtMLP28）同源建模可知,MdMLP423的结构与其他MLP成员相似,由7个β折叠和3个α螺旋组成,其中7片β折叠围绕羧基端一段长α螺旋（α3）构成一种Helix-grip折叠,另外结构中还形成一个疏水凹槽,与配体的结合进而发挥其生物学功能密切相关。（2）重组表达MdMLP423提高了原核细胞抗逆能力。将克隆得到的MdMLP423基因构建到pET30原核表达载体上,转化大肠杆菌细胞,在含有盐或渗透剂的胁迫培养基上观察MdMLP423的表达对细胞生存能力的影响,以转化空质粒为对照。结果表明,在NaCl、KCl或甘露醇固体培养基上,重组表达MdMLP423大肠杆菌的菌落数明显多于对照空质粒;在NaCl、KCl或甘露醇液体培养基中,重组表达MdMLP423大肠杆菌的生长速度明显高于对照,比对照更早到达对数生长期,这说明MdMLP423明显提高了原核细胞的抗逆能力。（3）Gly-rich loop影响MdMLP423的抗逆功能。MLP家族成员在第一个α螺旋与第二个β折叠之间有一段无规则卷曲,该序列上都有一段富含甘氨酸（Gly）的保守序列（GlyxxxxxGly）,称为Gly-rich loop,MdMLP423中该序列为Gly46Gly47Gly48xxxx Gly53。Gly-rich loop与配体结合发挥生物学功能有关。为了探究Gly-rich loop对MdMLP423功能的影响,利用定点突变技术,将4个Gly分别突变成与其结构性质相近的Ala。在含有盐胁迫培养基上观察MdMLP423突变体对细胞抗逆能力的影响,与野生型MdMLP423WT相比。MdMLP423G47A和MdMLP423G53A在固体胁迫培养基上大肠杆菌菌落数明显减少,接近转化空质粒的菌落数,表明抗逆功能几乎完全丧失,而MdMLP423G46A和MdMLP423G48A的菌落数与MdMLP423WT相似,抗逆功能不变,这说明47位和53位的Gly对MdMLP423发挥抗逆功能是必须的。（4）MdMLP423表达模式分析。将MdMLP423基因与GFP基因融合后转化烟草叶片,观察绿色荧光信号,结果显示MdMLP423定位于细胞质和细胞核中。利用GUS染色和qRT-PCR两种方法探究MdMLP423在不同组织中的表达情况,发现MdMLP423主要在叶、根、花、果实中表达。另外,非生物处理后,植株的染色加深,暗示MdMLP423响应非生物胁迫。qRT-PCR结果显示MdMLP423在ABA、NaCl、4℃和PEG胁迫处理后表达量均有一定程度的上调,表明MdMLP423的表达受非生物胁迫和ABA的诱导。（5）超表达MdMLP423提高了拟南芥的抗逆性。将构建好的pROKII-MdMLP423植物表达载体,利用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,然后经抗生素筛选和PCR鉴定得到超表达MdMLP423的纯合株系。在种子的萌发和根长实验中对野生型（WT）和MdMLP423超表达株系进行NaCl、甘露醇和外源ABA胁迫处理,与WT比。MdMLP423超表达株系的种子萌发率明显高于WT;在多种胁迫处理下,MdMLP423超表达株系的根长明显比WT的长。另外,还对超表达株系和WT的成苗进行了相应的胁迫处理,发现MdMLP423超表达株系和WT没有明显的差别。种子的萌发以及幼苗的根长实验表明,MdMLP423能够提高幼苗期拟南芥的抗逆能力。（6）MdMLP423提高了植物的抗逆能力可能与ABA信号途径有关。为了探究MdMLP423的抗逆机理,我们利用qRT-PCR的方法检测了ABA合成及信号途径的系列相关基因在WT和MdMLP423超表达株系中的表达变化。在非胁迫条件下,这些基因在WT和超表达株系中的表达量基本一致;在NaCl处理后,发现MdMLP423超表达株系中ABA信号转导途径的关键基因KINI、AnnAt1和ROS清除基因SOD、CAT的表达量明显高于WT,且ROS含量明显低于野生型。结果表明MdMLP423提高植物的抗逆能力可能与ABA信号途径及活性氧的清除有关。