【摘 要】
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目的:研究瓜蒌皮（Pericarpium Trichosanthis,PT）及瓜蒌薤白半夏汤（GXBD）各组分对缺血缺氧心肌细胞的保护作用及其与PI3K/AKT/eNOS信号通路的相关性。方法:（1）药物制备:取烘干后的瓜蒌皮,采用水煎煮法得瓜蒌皮水煎粗提组（PT0）,将瓜蒌皮水煎粗提液醇沉后取上清得瓜蒌皮水提物组（PT1）;将烘干后的瓜蒌、薤白、半夏、白酒按4:3:3:1的比例混合,采用水煎煮法
【基金项目】
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国家自然科学基金（项目编号:81573852），氧化应激对PI3K/AKT/eNOS通路的逆转在CAD痰浊壅塞证内皮祖细胞凋亡及中药干预中的作用机制，时间2016.01-2019.12；
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目的:研究瓜蒌皮（Pericarpium Trichosanthis,PT）及瓜蒌薤白半夏汤（GXBD）各组分对缺血缺氧心肌细胞的保护作用及其与PI3K/AKT/eNOS信号通路的相关性。方法:（1）药物制备:取烘干后的瓜蒌皮,采用水煎煮法得瓜蒌皮水煎粗提组（PT0）,将瓜蒌皮水煎粗提液醇沉后取上清得瓜蒌皮水提物组（PT1）;将烘干后的瓜蒌、薤白、半夏、白酒按4:3:3:1的比例混合,采用水煎煮法得GXBD水煎粗提组（GXB0）,采用乙醇回流提取后再经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇及水依次萃取后得GXBD石油醚组（GXB1）、GXBD氯仿组（GXB2）、GXBD乙酸乙酯组（GXB3）、GXBD正丁醇组（GXB4）、GXBD水萃组（GXB5）,将醇提后残留的药渣煎煮后得GXBD药渣水煎液组（GXB6）。（2）细胞处理:取3天内的大鼠乳鼠的心脏,解离提取心肌细胞,以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液在5%CO2,37℃培养箱中培养,设为对照组;以不含血清的DMEM原液在5%CO2、94%N2、1%O2的三气培养箱中培养,设为模型组。（3）药物最佳作用浓度的筛选:用添加了系列浓度的阳性药注射用丹参（SM）、PT1、PT0、GXB0、GXB1、GXB2、GXB3、GXB4、GXB5、GXB6的DMEM原液（0.1%DMSO助溶）培养模型细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态及溴化噻唑蓝四氮唑染色法（MTT）检测细胞存活率,筛选上述各组药物保护缺血缺氧心肌细胞的最适浓度。（4）机制研究:采用免疫荧光+激光共聚焦显微镜法及蛋白免疫印迹法检测各组心肌细胞内PI3K、AKT、eNOS蛋白及其磷酸化蛋白的定位及其表达量。结果:（1）各组细胞存活率:设对照组心肌细胞的存活率为100%,模型组细胞存活率为50%左右,与对照组相比有显著性差异（P＜0.01）;与模型组相比,SM、PT1、PT0、GXB0、GXB4、GXB5、GXB6处理的细胞存活率显著升高（P＜0.05）,每组最佳浓度分别为75mg/m L、0.5mg/m L、1mg/m L、1mg/m L、0.1mg/m L、0.2mg/m L、0.2mg/m L;GXB1、GXB2、GXB3处理后的细胞存活率无明显变化。（2）各组细胞内PI3K、AKT、eNOS蛋白的表达量及其磷酸化水平:与对照组相比,模型组PI3K、AKT、eNOS蛋白的表达量及其磷酸化水平显著降低（P＜0.01）;与模型组相比,PT1、PT0、GXB0、GXB4、GXB5组PI3K、AKT、eNOS蛋白的表达量及其磷酸化水平显著升高（P＜0.01）。结论:（1）PT1、PT0、GXB0、GXB4、GXB5、GXB6对缺血缺氧损伤的心肌细胞具有显著的保护作用,且该保护作用具有剂量依赖效应。（2）PT1、PT0、GXB0、GXB4、GXB5可能是通过激活PI3K/Akt/eNOS信号通路发挥保护缺血缺氧心肌细胞的作用。
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