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L-苏氨酸是目前工业上通过微生物发酵法生产产量排名第三的氨基酸,仅次于L-谷氨酸和L-赖氨酸。与后两者通过谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)发酵生产不同,L-苏氨酸通过大肠杆菌(Escherichia coli)发酵生产。C.glutamicum被普遍认为是氨基酸生产的理想宿主菌,尤其是食品/药品级氨基酸,但其L-苏氨酸的合成能力在过去20年中始终未获得突破性的提高。鉴于L-苏氨酸还是L-异亮氨酸以及L-高丙氨酸等药物中间体的合成前体,研究C.glutamicum中L-苏氨酸的高效合成具有重要意义。本论文从一株高产L-异亮氨酸的C.glutamicum IWJ001出发,运用反向代谢工程策略对其代谢通路进行理性重排,构建得到一株L-苏氨酸高产菌,并发现了L-苏氨酸和L-异亮氨酸生物合成机制的差异。主要研究结果如下:1、鉴定了C.glutamicum IWJ001的天冬氨酸激酶(AK1)、高丝氨酸脱氢酶(HD1)和高丝氨酸激酶(HK)。通过异源表达、纯化及酶活测定,确定了(1)AK1上的单位点突变A279T使其完全不受L-苏氨酸和L-赖氨酸的协同反馈抑制调节;当无抑制剂存在时,突变型AK1与来自C.glutamicum ATCC13869的野生型AK的比酶活相同。(2)HD1上的单位点突变G378S使其对L-苏氨酸反馈抑制调节具有一定耐受性,半最大抑制浓度在12至14 mM之间;当无抑制剂存在时,突变型HD1比来自ATCC13869的野生型HD的比酶活高约27%。2、通过对关键基因进行表达或敲除,初步探讨了C.glutamicum IWJ001中L-异亮氨酸高效合成的机制:(1)在IWJ001中敲除ilvA1基因,未实现L-苏氨酸积累,却造成丙酮酸节点碳流溢出,推测ilvA1编码的苏氨酸脱水酶TD1可能是IWJ001中L-异亮氨酸高效合成的主驱动力;(2)通过在野生型ATCC13869中组合表达来自IWJ001的lysC1、hom1、thrB、ilvA1以及ilvBN1考察其对氨基酸合成的影响,证实ilvA1是IWJ001中L-异亮氨酸高效合成的主驱动力。由此推测出ilvA缺失的C.glutamicum IWJ001(即DXW001)不积累L-苏氨酸的原因是该菌中L-苏氨酸合成途径驱动力不足。3、以DXW001作为出发菌,对其代谢途径进行理性重构:(1)通过高效表达来自E.coli的转运蛋白基因EcrhtC及合成途径关键基因hom1和thrB,使L-苏氨酸产量由0.22 g/L提高至3.42 g/L,糖酸转化率为0.12 g/g;(2)进一步敲除竞争旁路途径关键基因ilvBNC,构建出L-苏氨酸生产菌DXW002/p10-EcrhtC-hom1-thrB。该菌经72 h摇瓶发酵,可积累L-苏氨酸5.1 g/L,糖酸转化率为0.17 g/g。4、利用C.glutamicum中催化主要羧化回补途径的丙酮酸羧化酶活性对辅因子生物素的依赖性,丙酮酸脱氢酶全酶活性对辅因子D-泛酸的依赖性,以及DXW002/p10-EcrhtC-hom1-thrB的生物素和D-泛酸双重营养缺陷型表型,通过控制培养基中生物素和D-泛酸的供给调节回补途径和TCA循环基因的转录,实现前体草酰乙酸合成的加强及TCA循环通量的削弱,使L-苏氨酸的产量及转化率分别提高2.7倍和1.8倍,达到19.07g/L和0.47 g/g。与此同时,副产物积累大幅降低,仅积累0.34 g/L L-赖氨酸,0.29 g/L甘氨酸和0.12 g/L L-丙氨酸。此外,还发现DXW002/p10-EcrhtC-hom1-thrB的细胞生长及L-苏氨酸生产对生物素有依赖性;且当添加了最适浓度0.15 mg/L生物素之后,DXW002/p10-EcrhtC-hom1-thrB的生长及L-苏氨酸生产不再依赖于D-泛酸的添加。5、通过敲除草酰乙酸脱羧途径基因pck及副产物L-赖氨酸合成途径基因ddh,从减少碳的损耗及减少副产物积累两方面,进一步优化上述L-苏氨酸高产菌。最终构建得到的重组菌株DXW004/p10-EcrhtC-hom1-thrB L-苏氨酸产量为20.1 g/L,糖酸转化率达0.53 g/g。该转化率甚至略高于用于工业生产L-苏氨酸的E.coli菌株的转化率(0.4-0.5g/g)。而副产物仅有0.27 g/L甘氨酸和0.16 g/L L-丙氨酸。6、针对C.glutamicum L-苏氨酸和L-异亮氨酸生产中的共同主要副产物L-赖氨酸,探寻了既可减少L-赖氨酸积累又不至于阻碍细胞生长的解决方案,从野生型C.glutamicum ATCC13869通过敲除ddh和lysE构建得到不积累L-赖氨酸的重组菌XDW102,并进一步将其构建成L-苏氨酸生产菌TDW103和L-异亮氨酸生产菌IDW103。经验证,ddh和lysE缺失可大幅降低L-赖氨酸积累且不会减弱菌株的生长活力。此外,还发现:(1)ddh和lysE缺失使L-苏氨酸的产量提高了50%;(2)ddh缺失虽然对提高L-异亮氨酸产量作用很小,但显著促进了菌体细胞的生长,并使发酵终点的细胞密度提高了21%。