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目的:诸多研究认为肿瘤的发生发展与其肿瘤微环境的关系密不可分,而巨噬细胞是肿瘤微环境中最常见的免疫细胞。本研究从外泌体miRNA角度出发探索结直肠癌细胞(colorectal cancer,CRC)与巨噬细胞相互作用而使巨噬细胞失去抗肿瘤活性,并进一步证明这些miRNA是巨噬细胞改变的关键所在,为临床免疫治疗提供思路。方法:首先运用免疫组化法在CRC病人癌和癌旁组织切片中分别检测M2型巨噬细胞标志蛋白CD206的表达情况,检测人外周血单核细胞(PBM)与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)分泌的细胞因子的差别。CRC细胞与正常结肠细胞分别与巨噬细胞共培养,观察共培养后巨噬细胞的表型、功能及相关免疫状态变化:利用流式细胞术检测两种共培养后的巨噬细胞表面抗原CD206和HLA-DR水平;ELISA检测两种巨噬细胞上清中细胞因子IL-6、IL-10、IL-12的分泌情况;荧光定量PCR检测两种巨噬细胞中T细胞趋化因子CXCL-10和死亡配体PD-L1表达情况;Transwell检测两种巨噬细胞上清促进肿瘤细胞迁移的能力。接着收集CRC细胞和正常结肠细胞的外泌体,用上述相同的方法分析两种外泌体孵育后的巨噬细胞表型、功能及相关免疫状态变化。利用二代测序对收集到的CRC细胞及正常结肠细胞外泌体进行基因筛选,再结合临床样本验证得到外泌体中差异表达的miRNAs。分别转染miR-92a-3p及其NC到巨噬细胞,用相同的方法观察转染后巨噬细胞变化。构建pWPXL-miR-92a-3p的重组质粒,慢病毒包装后构建稳定表达miR-92a-3p的稳转株NCM460-pWPXL-miR-92a-3p及其对照细胞,收集稳转株的外泌体,再与巨噬细胞共培养,荧光定量PCR检测共培养后巨噬细胞中pre-miR-92a-3p和成熟体miR-92a-3p的含量。最后利用生物信息学方法寻找miR-92a-3p的下游靶点并进行通路分析及靶点验证。结果:(1)CD206在浸润肿瘤组织的巨噬细胞中高度表达,在癌旁组织中则表达较低或不表达,而且相对于PBM,TAM表达较多IL-10和M2型标志蛋白MRC-1,低表达IL-12和TNF-α。(2)与正常结肠细胞共培养的巨噬细胞相比,CRC细胞共培养后的巨噬细胞表达更多M2型标志蛋白CD206,低表达M1型标志蛋白HLA-DR;其细胞上清中含有更多IL-6和IL-10,而IL-12的丰度在两者间没有明显变化;另外,CRC细胞共培养的巨噬细胞高表达PD-L1,CXCL-10虽有下调趋势但差异没有意义。CRC细胞共培养后的巨噬细胞上清促进SW480迁移(P均<0.05)。(3)相较于与正常结肠细胞外泌体共培养的巨噬细胞(NCM460 exosome),CRC细胞外泌体(SW620 exosome)培养后的巨噬细胞高表达CD206、IL-6、IL-10、PD-L1且其上清促进CRC细胞迁移(P<0.05)。通过外泌体二代测序筛选及临床样本验证,我们得到5个在CRC分泌外泌体中高表达的miRNA(miR-16-5p、miR-21-5p、miR-200a-5p、miR-1246、miR-92a-3p)。(4)选择miR-92a-3p进一步研究,与NC对照相比,发现转染miR-92a-3p mimic后,巨噬细胞表面CD206的表达明显上升,分泌更多IL-10、IL-6,PD-L1显著上调,且其上清液促进SW480迁移(P<0.05)。(5)构建miR-92a-3p稳转株,收集细胞外泌体并证明了巨噬细胞内miR-92a-3p升高是由于外泌体输入所致。利用生物信息学方法分析miR-92a-3p的下游靶基因主要富集在FoxO信号通路并验证了下游靶点PTEN。结论:肿瘤微环境中CRC外泌体运载的miR-92a-3p可能是驯化巨噬细胞,使其向M2型极化,最终促进肿瘤细胞免疫逃逸和转移的原因所在。