细胞衰老的本质是细胞周期停滞导致细胞增殖和再生能力丧失,因此而造成组织结构和器官功能的适应性变化。增龄通常导致细胞发生复制性衰老,依赖端粒缩短以及端粒酶的调控,是一个程序化的生物学过程(Programmed biological process),其衰老速度和程度呈现出自主性和有序性,使衰老器官呈现出适应性变化而不是疾病表型。不过,越来越多的证据显示,各种病理性应激因素可以直接损伤DNA、激活原癌基因(Oncogene activation)或端粒缩短进而激活细胞周期负调控因子p16/Rb和/或ARF/p53,使细胞生长不可逆地停滞于G0/G1期,被称为应激诱导的早衰或细胞加速衰老。衰老细胞的特征性表现为细胞肥大、胞浆SA-β- gal活性增强、端粒缩短以及细胞周期负调控因子p16和p21阳性等。目前认为,无论程序化的自然细胞衰老还是疾病相关的细胞早衰,最终殊途同归,成为组织器官纤维化的重要病理生理基础;反之,细胞衰老机制障碍则导致肿瘤发生和转移。因此,细胞早衰与疾病导致器官纤维化的关系近年来受到高度关注。糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最为严重的并发症,极易进展为慢性肾衰竭。已证实,肾间质纤维化(Tubulointerstitial fibrosis,TIF)在糖尿病肾病走向慢性肾衰竭的进程中发挥主导作用,表现为肾小管上皮细胞丢失、慢性炎症和细胞外基质堆积,但发生机制尚不十分清楚。近年来研究发现,心肌细胞、内皮细胞、神经细胞以及间充质细胞等细胞早衰与心脑血管疾病的发生发展密切相关。来自于非老年相关的慢性肾脏疾病(CKD)的研究表明,肾实质细胞早衰通常伴有肾组织慢性损伤的组织学变化,例如肾小球硬化、肾小管萎缩和炎症反应等,提示细胞早衰是一种肾组织损害的病理表现形式,而非单纯增龄所致的生理性变化。新近研究发现,高糖可以引起肾实质细胞早衰,后者与肾组织结构和肾功能损害相关,提示细胞早衰可能不仅仅是DN的结果或伴随现象,还可能是促进DN走向慢性肾衰竭的主动参与者。不过目前并不完全清楚糖尿病肾病时肾小管上皮细胞早衰的原因和机制是什么?细胞早衰为什么会导致肾间质纤维化?终末期糖基化产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)是导致糖尿病肾病的主要原因之一。最近研究发现AGEs可引起足细胞和系膜细胞的细胞周期停滞和肾小球硬化。我们感兴趣的是AGEs是否也可以通过引起肾小管上皮细胞早衰在糖尿病肾病进展中发挥重要病作用。研究证实,AGEs、淀粉样蛋白β等有害物质可以通过影响内质网内稳态导致未折叠蛋白蓄积或蛋白质异常修饰引起细胞过度内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)。内质网应激是调控细胞存活、增殖和分化的关键机制,越来越多的证据显示,过度内质网应激不仅是糖尿病、心脑血管疾病等老年病以及慢性肾脏疾病进展的重要机制,而且还能影响甚至驱动衰老进程本身。过度ERS可以加速小鼠出现衰老相关的肾脏结构和功能变化。ATF4是一种碱性亮氨酸拉链转录因子(Basic leucine-zipper (bZip) transcription factor),通过与下游靶基因启动子结合调控诸多生物学效应,包括细胞增殖、分化、细胞凋亡、自噬以及炎症反应等,被认为哺乳类进化保守的应激反应途径中的主控调节因子(Master regulator)。在糖尿病、心血管疾病以及肿瘤的发生发展中发挥关键作用。最近的研究显示,ATF4基因沉默可以显著抑制人黑色素细胞(MC)衰老,过表达ATF4可抑制小鼠乳腺上皮细胞和神经细胞的细胞周期蛋白导致细胞生长停滞,提示ATF4可能对细胞衰老进程具有调控作用。据此,我们提出“AGEs引起过度内质网应激致肾小管上皮细胞早衰促进糖尿病肾间质纤维化—ATF4-p16/p21的作用”假说。(?)一、实验方法1.临床病例选取2009年2月至2010年12月重庆大坪医院肾内科收治的老年患者(即60岁以上)经病理确诊为2型糖尿病肾病病例20例,分为早期糖尿病肾病组(Pro: 500—2000 mg/day; Scr≤120umol/l,8例)和进展期糖尿病肾病组(Pro: >2000 mg/day; Scr >120umol/l,12例)。对照组8例,其肾组织标本均取自60岁以上的肾肿瘤患者切除肾脏的远离肿瘤部分经病理检查为正常肾组织(尿蛋白<500 mg/day; Scr: <120umol/l)。所有病例使用胰岛素控制血糖,CCB类降压药和利尿剂控制血压,在行肾活检3月内未服用任何中药。2.原代肾小管上皮细胞培养及鉴定无菌条件下获取2-3周龄C57/BL6雄性小鼠肾皮质,胶原酶消化肾组织,筛滤、分离、培养原代小鼠肾小管上皮细胞,细胞免疫荧光检测肾小管上皮细胞特异性表面标记物CK18的表达。将培养至第2代的肾小管上皮细胞用于以下实验,培养至第6代肾小管上皮细胞作为自然衰老细胞。3.细胞分组3.1. AGE-BSA作用肾小管上皮细胞的量效和时效分组量效分组:分别以0、0.15、0.75、1.5、7.5uM的AGE-BSA及相同浓度的BSA刺激肾小管上皮细胞48小时;时效分组:以7.5uM的AGE-BSA及同浓度的BSA分别刺激细胞0、12、24、36、48小时。3.3. ERS诱导剂作用肾小管上皮细胞的时效分组细胞分组为:正常对照组、DMSO组、TM组、TG组,其中TM和TG浓度分别为0.5ug/ml、0.1uM,分别培养48和72hour。3.4内质网应激抑制剂作用肾小管上皮细胞分组分为正常对照组、AGE-BSA组、AGE-BSA组+ 4-PBA组,其中AGE-BSA和4-PBA浓度分别为7.5uM、5mM,培养48hour。3.5. ATF4 siRNA转染肾小管上皮细胞分组分别以脂质体Lipofectamine? 2000加对照siRNA(0.05μM)、ATF4 siRNA(0.05μM)转染肾小管上皮细胞24 h后,细胞分组为:对照组、对照组+ Con siRNA组、对照组+ATF4 siRNA组、BSA组、BSA组+Con siRNA组、BSA组+ ATF4 siRNA组、AGE组、AGE组+Con siRNA组、AGE组+ ATF4 siRNA组,其中BSA和AGE浓度均为7.5uM,培养48hour。3.6. ATF4 -GFP转染肾小管上皮细胞分组细胞分组为:对照组、GFP-空载体组,ATF4-GFP组,其中GFP-空载体、ATF4-GFP腺病毒滴度为5×108PFUml,转染48hour。4.检测指标与方法4.1 ELISA检测糖尿病肾病患者血清及尿AGEs水平采用ELISA试剂盒检测DN患者血清及尿AGEs水平。4.2免疫组化检测肾小管上皮细胞GRP78、ATF4表达石蜡包埋组织切片2～4um厚,脱蜡、水化;高压法修复抗原;3%H2O2室温孵育15min;PBS冲洗;山羊血清封闭15min;一抗GRP78 (1:400)、ATF4 (1:50 )、4℃孵育过夜;PBS冲洗;滴加辣根过氧化物酶标记抗小鼠或抗兔IgG,室温孵育30min;PBS冲洗;DAB镜下显色;苏木素复染;脱水透明、封片。4.3免疫荧光检测肾小管上皮细胞GRP78、ATF4、p16、p21、FN、ColⅢ和TGF-β表达与分布冰冻切片冷丙酮固定20min或细胞常规爬片后多聚甲醛固定20min,PBS冲洗;山羊血清封闭15min;一抗4℃过夜;PBS冲洗;分别滴加二抗FITC标记的IgG (1:50)和Cy3标记的IgG (1:50),37℃孵育1hou;PBS冲洗;DAPI染核;甘油封片,激光共聚焦下观察。4.4常规生化方法检测肾小管上皮细胞SA-β-gal表达按照SA-β-gal染色试剂盒操作步骤,予PH=6.0的酸性液清洗后滴加SA-β-gal染色工作液,37℃孵育12hour,室温晾干、封片。4.5结果判读方法:①肾小管上皮细胞SA-β-gal阳性染色率:光学显微镜下见肾小管上皮细胞呈蓝色者为SA-β-gal阳性,参考Verzola等人[7]的检测方法,每张切片至少随机计算10个高倍视野,以SA-β-gal阳性染色的肾小管占总共肾小管的比例表示SA-β-gal阳性百分比;②肾小管上皮细胞p16、p21双阳性细胞百分比:激光共聚焦观察计数肾小管上皮细胞胞核p16、p21呈双阳性表达的肾小管上皮细胞占肾小管上皮细胞总数的百分比例;③肾小管上皮细胞GRP78、ATF4表达评分:计数GRP78呈阳性表达的肾小管上皮细胞或胞核ATF4呈阳性表达的肾小管上皮细胞占肾小管上皮细胞总数的百分比例,,结果分为4级:0分:无阳性染色或单个阳性染色的细胞;1分:弱表达,阳性率10%～35%;2分:中度表达,阳性率35%～70%;3分:强表达,阳性率> 70%。每张切片在低倍视野下(×100倍)随机选择10个视野,取其平均值。注:上述结果的判读均采用盲法进行,由2名与本研究无关人员实施。4.6 DAPI法检测肾小管上皮细胞衰老相关异染色质凝聚(SAHF)改变细胞爬片;4%多聚甲醛固定30min;PBS冲洗;DAPI染核;甘油封片,激光共聚焦下观察。4.7 Brdu标记法检测肾小管上皮细胞增殖Brdu标记液37℃避免孵育90min;PBS冲洗;冷丙酮固定20min;PBS冲洗;山羊血清封闭15min;滴加一抗Brdu, 4℃过夜;PBS冲洗;滴加FITC标记的IgG ,37℃孵育1hour;PBS冲洗;DAPI染核;甘油封片,激光共聚焦下观察。4.8流式细胞技术检测肾小管上皮细胞周期比值采用细胞流式分析试剂盒和细胞流式仪检测细胞周期。流式细胞技术分选AGE组和自然衰老组G0G1期细胞,提取细胞总蛋白,采用western blot检测TGF-β、ColⅢ蛋白的表达。4.9 RT-PCR法检测肾小管上皮细胞ATF4、p16和p21 mRNA表达水平TRIZOL法提取细胞总RNA ,在20μL反应体系中进行逆转录反应,以cDNA为模板,进行核酸定量。以β-actin作为内参对照,引物序列如下: ATF4上游: 5’GCCCCCTTTACATTCTTGCAGC 3’,下游5’GAGGGGCTATGCTGGGGAGA 3’ p16上游5’GCCAATCCCAAGAGCAGAGC 3’,下游5’CCGCCTTCGCTCAGTT TCTC 3’ , p21上游5’GCCTTGTCGCTGTCTTGCACT 3’ ,下游5’GAGAGGG CAGGCAGCGTATATA 3’;β-actin上游5’CAACTCCATCATGAAGTGTAAC3’,下游5’CCACACGGAGTACTTGCGCTC 3’,采用20μL反应体系在ABI 7500实时荧光定量基因扩增仪进行PCR扩增。对PCR反应过程中每一循环荧光信号进行实时监测,获得Ct值,对2 -??Ct进行统计分析。4.10 Western blot法检测肾小管上皮细胞GRP78、ATF4、p16、p21、TGF-β、ColⅢ蛋白的表达提取细胞总蛋白;考马斯亮蓝法检测蛋白浓度;蛋白高温变性;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离;转膜;5%脱脂牛奶封闭2 h,加入一抗GRP78 (1:200)、ATF4 (1:200)、p16 (1:200)、p21 (1:200)、TGF-β(1:1 000)、ColⅢ(1:1 000),4℃过夜;TBST缓冲液冲洗;加入二抗辣根过氧化物酶标记IgG (1:1 0000),室温孵育1 h;TBST缓冲液冲洗;暗室中发光,X光胶片曝光、显影、定影。4.11免疫共沉淀检测肾小管上皮细胞ATF4蛋白与p16、p21蛋白之间相互作用分别提取对照组、AGEs组、AGEs+ATF4 siRNA组、ATF4-GFP组肾小管上皮细胞总蛋白,蛋白质分3份,其中一份做Input,剩下的2份分别用抗ATF4单克隆抗体和兔免疫血清(对照IgG)沉淀相应的抗原,然后用protein A-agarose把抗原抗体复合物吸附于agarose珠子上,离心清洗其他蛋白质,再用上样缓冲液和高温变性方法使agarose珠子与蛋白质复合物分离,经SDS-PAGE把抗原和抗体分离,Western blotting分析ATF4、p16和p21蛋白表达。4.12统计学方法:计量资料均以均数±标准差(x__±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way-ANOVA),相关性检验采用直线相关分析。结果以P<0.05为相差显著。二、结果AGEs诱导肾小管上皮细胞早衰的作用和意义1.1AGEs诱导肾小管上皮细胞早衰的作用体内研究发现,糖尿病患者eGFR显著降低,24h尿蛋白水平、血清AGEs水平及尿AGEs/Cr显著高于同龄对照组水平(P<0.05),血AGEs水平与eGFR的变化呈显著负相关关系(r=—0.722,P<0.05)。糖尿病患者肾组织胞浆SA-β-Gal阳性的肾小管上皮细胞显著增多,胞核p16、p21双阳性的肾小管上皮细胞比例增加,且与尿AGEs/Cr呈显著正相关关系(r=0.735,P<0.05;r=0.579,P<0.05)。结果提示糖尿病肾病时肾小管上皮细胞早衰与肾脏排泄AGEs增加有关。体外实验发现,随AGE-BSA作用浓度和时间递增,肾小管上皮细胞SA-β-gal、SAHF阳性率以及G0/G1期细胞比例均显著增高(P<0.05),Brdu核阳性细胞比例显著降低(P<0.05)。Western bolt检测显示AGEs上调肾小管上皮细胞p16和p21蛋白表达。结果表明AGEs可导致肾小管上皮细胞早衰。1.2肾小管上皮细胞早衰与糖尿病肾病肾间质病变的关系免疫荧光检测发现,DN患者肾间质p16、p21阳性肾小管上皮细胞增多与ColⅢ、FN表达增加的部位一致;AGEs孵育后,SAHF阳性的肾小管上皮细胞体积增大且胞浆中TGF-β表达增加,这与体外培养的第6代自然衰老肾小管上皮细胞的变化一致。Western bolt检测显示,以流式细胞仪分选出AGEs孵育后的G0/G1期肾小管上皮细胞TGF-β和ColⅢ表达增加。结果提示AGEs诱导的早衰肾小管上皮细胞产生细胞基质增加,参与糖尿病肾病肾间质纤维化的发生发展。2.内质网应激在AGEs诱导肾小管上皮细胞早衰中的作用免疫组化检测显示,DN患者肾小管上皮细胞胞浆内质网伴侣分子GRP78表达显著高于正常对照组(P<0.05)。免疫荧光检测发现GRP78阳性的肾小管上皮细胞,其胞核p16、p21也呈阳性,而对照组尽管GRP78有基础量表达,但胞核p16、p21呈阴性。结果提示糖尿病肾病肾小管上皮细胞过度内质网应激可能与细胞早衰有关。体外研究,Western blot检测结果显示,AGEs上调肾小管上皮细胞GRP78表达,与AGEs具有时效和量效依赖关系。免疫荧光显示,AGEs与肾小管上皮细胞孵育后,其胞浆GRP78和胞核SAHF双阳性以及胞浆GRP78和胞核p16双阳性的细胞较对照组显著增多。结果提示AGEs引起过度内质网应激可能与细胞早衰有密切关系。将内质网应激抑制剂4-PBA预处理的肾小管上皮细胞与AGEs进行孵育,结果发现肾小管上皮细胞GRP78蛋白表达显著降低(降低52.3%);SA-β-gal、SAHF阳性细胞以及G0/G1期细胞的比例显著降低(P<0.05),Brdu核阳性细胞比例显著增高(P<0.05)。结果表明,抑制内质网应激可以减轻AGEs诱导的肾小管上皮细胞早衰。为进一步证实内质网应激与细胞早衰的关系,分别将内质网应激诱导剂TM和TG与第二代肾小管上皮细胞进行孵育。结果显示,TM和TG能显著上调肾小管上皮细胞p16、p21蛋白表达(P<0.05),且SA-β-gal、SAHF阳性细胞和G0/G1期细胞比例均显著增高(P<0.05),Brdu核阳性细胞显著降低(P<0.05)。激光共聚焦检测显示,TM和TG与肾小管上皮细胞孵育后,其胞浆GRP78和胞核SAHF双阳性以及胞浆GRP78和胞核p16双阳性的细胞较对照组显著增多。提示内质网应激诱导剂可通过激活内质网应激引起肾小管上皮细胞早衰。AGEs激活内质内质网源性转录因子ATF4与肾小管上皮细胞早衰及间质纤维化的关系免疫组化检测发现,对照肾组织中ATF4仅在肾小管上皮细胞胞浆有少量表达,DN患者ATF4发生核转位,且ATF4阳性细胞显著增多。激光共聚焦检测显示,DN患者肾小管上皮细胞胞核ATF4与p16双阳性以及ATF4与p21双阳性的细胞增多,而对照组未检测到肾小管上皮细胞胞核ATF4、p16和p21阳性表达。体外研究显示, AGEs显著上调肾小管上皮细胞ATF4表达,两者具有浓度和时间依赖关系(P<0.05)。激光共聚焦检测显示,AGEs组体积增大的ATF4阳性肾小管上皮细胞增多,而对照组肾小管上皮细胞形态正常,胞浆仅有少量ATF4阳性信号;此外,AGEs组肾小管上皮细胞胞核ATF4与p16双阳性以及ATF4与p21双阳性的细胞较对照组显著增多,提示AGEs引起的细胞早衰可能与ATF4被激活有关。我们进一步采用ATF4基因沉默和ATF4过表达技术,验证ATF4介导肾小管上皮细胞早衰的作用。结果发现,ATF4 siRNA可显著抑制肾小管上皮细胞ATF4 mRNA和蛋白的表达,抑制效率分别为79.32%、74.08% (P<0.05)。ATF4基因沉默可以显著减少AGEs组SA-β-gal、SAHF阳性细胞比例以及G0/G1期细胞(P<0.05),Brdu阳性细胞比例显著增高(P<0.05),p16和p21表达减少,Col III表达减少。以携带ATF4-GFP质粒的腺病毒转染肾小管上皮细胞(转染效率为96.78%)后,其ATF4蛋白表达较对照组增加9.45倍。进一步观察ATF4高表达对肾小管上皮细胞早衰表型的影响。结果发现,ATF4质粒转染组SA-β-gal、SAHF阳性细胞比例以及G0/G1期细胞与对照组比较显著增多(P<0.05),Brdu阳性细胞比例显著降低(P<0.05);western bolt检测显示,p16和p21表达增加,Col III表达也显著上调。激光共聚焦交显微镜下观察发现,ATF4转染组ATF4与p16双阳性以及ATF4与p21双阳性的细胞显著增多,而对照组未见ATF4、p16和p21阳性信号;此外,ATF4转染组TGF-β表达增加,而对照组未见TGF-β表达。结果表明AGEs可激活ATF4介导肾小管上皮细胞早衰和细胞外基质表达。以免疫共沉淀方法验证ATF4与p16、p21之间的相互作用。结果发现,以ATF4沉淀抗原后,AGEs组可分别检测到ATF4-p16和ATF4-p21复合体存在,而对照组为阴性。ATF4 siRNA转染的肾小管上皮细胞与AGEs孵育后,未检测到ATF4-p16和ATF4-p21复合体条带。ATF4质粒转染肾小管上后,可检测到ATF4-p16和ATF4-p21复合体存在。上述结果表明AGEs可激活ATF4直接调控p16和p21的生物学作用。三、结论过度内质网应激激活ATF4-p16/p21途径是AGEs引起肾小管上皮细胞早衰的新机制,后者通过增加细胞外基质的表达促进糖尿病肾病肾间质纤维化。