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布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患传染病,该病呈全球性分布,主要引起公畜生殖障碍和孕畜流产,通过接触患病动物或食用带有病原菌的食物传染给人,对畜牧业发展和人类健康构成巨大的威胁。布鲁菌是一种兼性胞内寄生菌,可入侵宿主细胞并在胞内生存和繁殖,并建立慢性感染,但其致病机制尚未完全揭示,因此本研究通过对流产布鲁菌毒力相关基因vhpA和vhpB1/2的功能分析,以及构建报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,旨在进一步阐明布鲁菌的相关致病机制,并为布鲁菌毒力相关基因的研究奠定基础。1.小蛋白VhpA在布鲁菌致病过程中的功能研究通过生物信息学分析发现vhpA基因编码一个在根瘤菌目中高度保守的小蛋白。为研究该基因的功能,构建流产布鲁菌S2308菌株vhpA基因缺失株以及互补株。对缺失株的表型分析结果表明,缺失株的生长曲线和LPS结构与野毒株无明显差异。通过比较缺失株与野毒株的毒力发现该基因与流产布鲁菌毒力相关,但与布鲁菌对细胞的黏附、入侵,以及胞内存活能力不相关。耐受性试验结果表明,缺失株对H2O2、多粘菌素B和硝普化钠的敏感性与野毒株无明显差异。进一步研究表明,苜蓿中华根瘤菌和土壤农杆菌中vhpA基因的同源基因无法回复缺失株的毒力。2.小蛋白VhpA调控布鲁菌毒力机制的研究为进一步研究vhpA基因的功能,通过比较转录组测序,比较缺失株和野毒株在RNA转录水平的差异,发现vhpA基因的缺失影响流产布鲁菌多个基因的转录。通过实时荧光定量PCR验证,确定了5个下调基因和4个上调基因,并分别将下调基因在缺失株中回补表达,将上调基因在野毒株中过表达;测定重组菌株对小鼠的致病性,结果发现vhpB1和vhpB2两个基因的过表达可以显著减弱野毒株对小鼠的致病性。对vhpB1基因和vhpB2基因编码的蛋白进行生物信息学分析发现这两个蛋白高度同源,且通过RT-PCR验证表明两个基因共转录为一个多顺反子mRNA;为进一步研究vhpB1和vhpB2的功能,后续成功构建了vhpB1/2基因缺失株和互补株,发现这两个基因的缺失同样可以显著减弱流产布鲁菌对小鼠的致病性。vhpB1基因和vhpB2基因被注释为编码未知功能的假定蛋白,进一步通过免疫印迹分析、测定启动子活性和过表达ORF序列证明这两个基因在流产布鲁菌中可以翻译为蛋白质。3.报告布鲁菌基因启动子活性质粒的构建和应用vhpB1/2基因可能通过不同的转录和表达水平对布鲁菌毒力进行精确调控,启动子作为启动基因转录和表达的重要结构,vhpB1/2基因在特定条件下的转录和表达可通过测定其启动子的活性来进行分析,因此需要通过精确分析vhpB1/2基因启动子的活性来研究其精确调控机制。基于NanoLuc荧光素酶高度灵敏的特点,本研究成功获得NanoLuc荧光素酶重组蛋白,并制备多克隆抗体;以广宿主质粒pBBR1MCS为骨架构建了基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并通过测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性验证该方法的可行性。