【摘 要】
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鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)发生和发展是一个多因素作用、多基因参与、经过多阶段才形成的极其复杂的生物学过程。鼻咽癌存在一定的地理分布和种族分布。在中国南部,东南亚地域几乎分布非角化型的鼻咽癌,在未分化鼻咽癌中EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)的感染率几乎达到100%。在1973年,研究指出NPC和EBV之间存在联系[1]。然而,EBV在鼻
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鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)发生和发展是一个多因素作用、多基因参与、经过多阶段才形成的极其复杂的生物学过程。鼻咽癌存在一定的地理分布和种族分布。在中国南部,东南亚地域几乎分布非角化型的鼻咽癌,在未分化鼻咽癌中EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)的感染率几乎达到100%。在1973年,研究指出NPC和EBV之间存在联系[1]。然而,EBV在鼻咽癌发病机制中的作用很大程度上仍是未知的。EB病毒癌基因导致宿主细胞肿瘤相关基因功能异常,进而引起细胞转化是其致癌基础。由于EBV仅感染人类及少数灵长类,目前尚缺乏有代表性的EBV感染的鼻咽癌动物模型和细胞模型。即使EBV阳性鼻咽癌细胞株在体外成功培养,但经过长时间的繁殖传代(10-20代)后也会迅速丢失其EBV基因组,不利于EBV和NPC之间联系的相关研究。建立具有EBV稳定感染鼻咽癌细胞系是研究NPC和EBV的重要课题。目的:目前在体外培养鼻咽癌细胞研究中,大多数EBV阳性鼻咽癌细胞会随着细胞传代而丢失EBV基因组。本课题研究主要目的是通过F因子质粒介导外源性EBV基因组导入鼻咽癌细胞中,为鼻咽癌与EBV相关研究提供一个简易的EBV阳性鼻咽癌细胞模型;并观察外源性EBV基因组对鼻咽癌恶性生物学行为包括增殖、迁移、凋亡、周期及鼻咽癌相关信号通路JAK/STAT、(PI3K)-AKT和NF-κB的影响。阐明该模型的分子和生物学特性,为该模型的进一步应用提供基础数据。方法:1.通过用Lipofectamine?3000瞬时转染,将F因子质粒介导外源性EBV基因组导入鼻咽癌HONE1细胞中,构建HONE1-EBV细胞模型。2.免疫印迹试验检测鼻咽癌HONE1-EBV细胞潜伏膜蛋白LMP1的表达,免疫杂交检测EBERs的表达。3.CCK8实验检测外源性EBV基因组对鼻咽癌细胞增殖影响。4.流式细胞仪分析外源性EBV基因组对鼻咽癌细胞周期分布和细胞凋亡影响。5.划痕实验和小室实验检测外源性EBV基因组对鼻咽癌细胞迁移能力影响。6.免疫荧光检测细胞外源性EBV基因组对鼻咽癌细胞骨架和细胞形态的改变。7.免疫印迹检测外源性EBV基因组对JAK/STAT,(PI3K)-AKT,NF-κB鼻咽癌相关信号通路蛋白STAT3、p STAT3(Tyr705)、p STAT3(Ser727)、AKT、p AKT(Ser473)、P65、p P65(Ser536)和恶性生物学相关蛋白E-cadherin、Bcl-2、Cyclin D1的表达。结果:1.外源性EBV基因组导入HONE1鼻咽癌细胞中,在HONE1-EBV细胞成功表达了LMP1蛋白和EBERs。2.外源性EBV基因组导入HONE1鼻咽癌细胞中,显著增加细胞增殖,促进了细胞周期进展。3.外源性EBV基因组导入HONE1鼻咽癌细胞中,显著促进了细胞迁移;免疫荧光显示,细胞伪足增加,形态呈梭形改变。4.外源性EBV基因组导入HONE1鼻咽癌细胞中显著抑制细胞凋亡。5.外源性EBV基因导入HONE1鼻咽癌细胞显著地抑制JAK/STAT信号通路,同时激活(PI3K)-AKT和NF-κB肿瘤信号通路。结论:F因子质粒p2089介导的外源性EBV基因组导入鼻咽癌细胞成功构建了EBV阳性鼻咽癌细胞模型;该模型部分模拟了EBV潜伏期II型感染鼻咽癌状态。这个模型可作为EBV与鼻咽癌关系的研究提供一个简易的细胞模型,但必须考虑在肿瘤相关信号通路改变上的差异。
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