血管生成又称为血管新生，是指毛细血管从原血管以出芽方式形成新血管床的过程。它参与如肿瘤、慢性炎症、糖尿病性视网膜病等病理过程，寻找体内外有效地抗血管生成抑制剂对此类血管生成性疾病的治疗具有十分重要的意义。 我们采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型及动脉环体外无血清培养形成微血管样结构的方法，进一步研究CCVAF抗血管生成作用，并从细胞水平的角度，探讨CCVAF对血管内皮细胞结构及分泌功能的影响。 本实验分为两个部分： 第一部分：中华眼镜蛇毒活性组分体内外抗血管生成作用的研究 目的：利用血管生成体内外实验模型，观察中华眼镜蛇毒活性组分体内外抗血管生成的作用。 方法：一、鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型。 采用9日龄鸡胚，开窗无菌暴露CAM，于CAM局部给药，恒温(37.5±0.2℃)、饱和湿度(55％-60％)下孵育，48h后观察结果。实验中设培养基空白对照组及VEGF阳性对照组，受试组为CCVAF各剂量组(0.05μg/胚、0.1μg/胚、0.2μg/胚、0.4μg/胚、0.8μg/胚)，另设一组(VEGF+CCVAF)，共分8组，每一实验组n=10。 观察项目或数据处理：鸡胚存活率；CAM用药局部血管形态观察；图像显微分析，测定各组血管面积。 二、大鼠动脉环体外无血清培养形成微血管样结构的方法。 按文献报道的方法制备动脉环培养模型，实验中选用MCDB131无血清培养基，对照组设培养基空白对照及VEGF(20ng/ml)阳性对照，受试组为CCVAF(2.0μg/ml)及VEGF(20ng/ml)+CCVAF(2.0μg/ml)，每一试验组n=6。动脉环在无血清的生理条件下培养，每隔两天换液(药)，观察培养3～15天后动脉环断面细胞生长及微血管生成的情况。 结果：一、鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型 1.实验过程中鸡胚存活率的观察：实验中除培养基空白对照组及CCVAF0.05μg组各有1只鸡胚因污染死亡外，其余各组鸡胚的存活率为100％。 2.CAM用药局部血管的形态观察：培养基空白对照组CAM用药局部血管正常发育，血管丰富发达，脉络清晰；CCVAF0.05μg组，血管清晰，较细；CCVAF0.1μg组，血管出现模糊，微细血管减少；CCVAF0.2μg组，血管模糊明显，微细血管进一步减少；CCVAF0.4μg组，血管模糊严重，微血管几乎消失；CCVAF0.gμg组，微血管消失，血管模糊，CAM局部颜色变浅。VEGF对照组血管网络发达、分支多、血管粗壮；CCVAF0.4μg+VEGF组，与VEGF对照组血管相比，血管明显变细，分支减少。 3.通过图像显微分析，CCVAF能够剂量依赖性减少用药局部血管面积，CCVAF每胚用药剂量为0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.4μg、0.8μg时，实验区域血管面积与对照组血管面积相比，减少率分别为9.10％、26.29％、46.08％、64.51％、66.70％，血管面积的减少程度与CCVAF用药剂量呈正相关(r=0.848，P＜0.001)。 二、大鼠动脉环体外无血清培养形成微血管样结构观察 1.培养后第4天，空白对照组动脉环周围有较多的内皮细胞(团)迁移、增殖，可见短小血管芽开始从动脉环断面长出；VEGF对照组动脉环周围内皮细胞(团)增殖、迁移明显比对照组多，血管芽开始从动脉环断面长出；CCVAF2.0μg组观察到动脉环周围只有少数几个内皮细胞迁移、增殖，不见血管芽从动脉壁长出；而VEGF+CCVAF2.0μg试验组可观察到动脉环周围有少量内皮细胞迁移、增殖，不见血管芽从动脉壁长出； 2.培养后第10天，空白对照组新生微血管数量达30多条，VEGF对照组新生微血管数量多达60多条；CCVAF2.0μg试验组只见散在分布的内皮细胞，不见新生血管芽出；VEGF+CCVAF2.0μg可见十几条小絮丝状新生血管。 3.大鼠动脉环体外无血清培养结果显示，大鼠动脉环在体外无血清条件下可形成微血管腔样结构；VEGF能促进体外管腔样结构的形成；中华眼镜蛇毒活性组分能够抑制内皮细胞从动脉环断面周围增殖、迁移，使其不能形成管腔样结构，从而抑制微血管的芽生；VEGF的促血管生成作用能被CCVAF拮抗。 结论：1.中华眼镜蛇毒活性组分能够剂量依赖性抑制鸡胚绒毛尿囊膜微血管的生成；能够拮抗VEGF促血管生成作用，具有体内抗血管生成的作用。 2.中华眼镜蛇毒活性组分能够抑制大鼠动脉环体外无血清培养微血管样结构的形成，并且能够拮抗VEGF促微血管生成作用，具有体外抗微血管生成作用。 第二部分 中华眼镜蛇毒活性组分对新生牛肺主动脉内皮细胞结构及分泌功能的影响 目的：考察CCVAF对新生牛肺主动脉血管内皮细胞增殖、细胞形态结构及分泌功能的影响，进一步探讨CCVAF抗血管生成可能的细胞机制。 方法：1.应用MTT法，研究CCVAF在高浓度血清、VEGF等共存下对新生牛肺主动脉血管内皮细胞增殖作用的影响；应用免疫组化方法，检测CCVAF对新生牛肺主动脉血管内皮细胞增殖胞内原癌基因c-fos、c-myc及核增殖基因PC她表达的影响。 2.采用细胞骨架染色及胞内骨架蛋白F-actin定位的方法，考察CCVAF对新生牛肺主动脉血管内皮细胞形态、骨架结构的影响。 3.采用流式细胞仪法分析CCVAF对血管内皮细胞胞内钙离子的影响。 4.利用分光光度计，按照试剂盒测定方法，检测CCVAF作用于血管内皮细胞后，细胞培养上清液中分泌LDH及NO的影响。 结果：1.MTT法实验表明，CCVAF在1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml时能够抑制新生牛肺主动脉血管内皮细胞的增殖，抑制率分别为22％、54％、82％，呈现良好的量效依赖关系；CCVAF亦能显著抑制由高浓度血清及VEGF激发的内皮细胞的过度增殖，其抑制率分别为：20.01％、44.87％、78.99％及18.51％、39.23％、72.36％，呈量效依赖关系。 2.免疫组化方法检测结果表明，CCVAF2.5μg/ml时，能够抑制胞内原癌基因c-fos、c-myc及核增殖基因PCNA的表达，抑制率分别为：47.1％、89.7％、88.0％，与空白对照组相比，具有极显著差异。 3.细胞伊红－考马斯亮蓝法染色，相差显微镜观察正常对照组内皮细胞呈扁平、多角形、单层镶嵌状紧密排列，可见细胞连接紧密、清晰。正常对照组细胞骨架纤维走行清晰可见，多角形细胞相互紧密粘附，形成一个密合的单层细胞胞膜。CCVAF1.25μg/ml药物刺激组，部分细胞出现收缩现象，部分细胞脱落。原来紧密排列的细胞单层上出现许多裂隙，细胞间连接减少甚至消失。 4.细胞骨架蛋白定位，通过特异性结合F-actin蛋白的罗丹明-鬼笔环肽探针标记显示，正常对照组细胞F-actin蛋白主要分布在细胞的周边，分布于细胞膜，呈“花环”样，少量呈细丝状无序地分布于胞浆，胞内也有少许丝状纤维，细胞比较饱满，呈自然轮廓；而CCVAF1.25μg/l刺激4h后，细胞F-actin分布明显混乱，有的细胞有应力纤维形成；细胞内F-actin的构像和分布发生变化，边聚现象消失，胞浆内的F-actin明显增多，呈极性分布，细胞自然轮廓改变，呈不规则形。 5.流式细胞仪法分析血管内皮细胞胞内钙离子的结果显示，牛肺主动脉血管内皮细胞在CCVAF0.3μg/ml、0.6μg/ml、1.2μg/ml、2.4μg/ml、4.8μg/ml作用下，其平均细胞内钙荧光强度值随剂量的加大而明显升高。当浓度为4.8μg/ml时达峰值，浓度继续加大(9.6μg/ml)而细胞[Ca]2+i有所回落。 6.细胞培养上清液中LDH的含量测定结果显示，CCVAF0.312μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml作用于细胞3h后，各浓度组细胞培养上清中LDH含量依次增加，表明细胞中LDH漏出随剂量加大而显著增加。 7.细胞培养上清液中NO的含量测定结果显示，CCVAF0.625μg/ml对细胞分泌NO的影响与其作用的时程有关，作用1h，对NO的影响无显著性；CCVAF作用3h后，NO的分泌量为对照组的2倍；而到了6h，NO的分泌量则有所下降。NO合成酶抑制剂L-NAME作用下细胞分泌NO减少，而CCVAF0.312μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml可拮抗L-NAME的作用，NO分泌量随CCVAF剂量加大而增加。 结论：1.中华眼镜蛇毒活性组分能够抑制新生牛肺主动脉血管内皮细胞的增殖，抑制胞内原癌基因c-fos、c-myc及核增殖基因PCNA的表达可能是其抑制内皮细胞增殖的胞内机制之一。 2.中华眼镜蛇毒活性组分对血管内皮细胞的形态、结构及分泌功能有影响，使细胞间连接减少，胞内F-actin的构像和分布发生变化；细胞膜通透性变大，细胞内钙浓度增加，LDH漏出增多，对NO分泌量的影响依作用时间呈双向作用。