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结核病是由结核分枝杆菌感染引起的世界性传染病,尤其是在发展中国家形势更加严峻,我国是世界上结核病发病率最高的22个国家之一,结核病患病人数仅次于印度,位居第二。卡介苗是目前唯一应用于结核的预防性疫苗,但对于成人肺结核的保护效力十分有限,再加上其自身的不足以及外界因素的变化,研制新型的结核疫苗对于结核病的防治来讲显得尤为重要。DNA疫苗是一种常见的基因疫苗,1993年Ulmer等首篇研究报道发表在Science上之后,该发现立即被视为疫苗领域的一场革命,开辟了疫苗研究的新时代。从此,基因疫苗成为世界瞩目的防治传染病的研究新热点。本研究应用分子克隆技术构建新型的结核分枝杆菌DNA疫苗,即pVAX1-Rvl419重组质粒,并评价了该疫苗在小鼠体内的免疫原性。一、Rv1419基因真核表达质粒的构建以H37Rv基因组为模板,通过PCR扩增rv1419基因,获得长401bp的rv1419基因片段,回收目的基因片段插入pGEM-T载体中,经酶切鉴定与序列测定证实后,双酶切回收目的基因片段,再与双酶切后的真核表达载体pVAX1连接,构建真核表达质粒pVAX1-Rv1419。重组真核表达质粒pVAX1-Rv1419经酶切鉴定及基因测序证实构建成功。应用金牌超量无内毒素试剂盒大量提取并纯化质粒DNA。二、Rv1419DNA疫苗在小鼠体内的免疫原性评价将50只BALB/c雌性小鼠随机分为5组,每组10只,分别用生理盐水、pVAX1载体、微卡菌苗、Ag85A DNA疫苗、Rv1419DNA疫苗免疫,通过双侧胫前肌注射的方法免疫小鼠,每2周免疫1次,共免疫3次,第3次免疫后3周杀死小鼠。通过ELISA方法检测血清中抗Rv1419的IgG抗体；利用ELISA方法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4表达水平；应用流式细胞术检测外周血单个核细胞内分泌IFN-γ的Thl和分泌IL-4的Th2细胞百分比以及Th1/Th2比值。结果显示Rv1419DNA疫苗免疫的小鼠特异性抗体IgG高于生理盐水组和载体质粒组(P<0.05),与微卡菌苗组无显著性差异。Rv1419DNA疫苗组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平显著高于生理盐水组、载体质粒组和微卡菌苗组(P<0.05),但低于Ag85A DNA疫苗组。Rv1419DNA疫苗组Thl细胞百分比显著高于生理盐水组和载体组(p<0.01),且Th1/Th2细胞比值显著高于生理盐水组和载体组(P<0.01),与微卡菌苗组和Ag85A DNA疫苗组无显著性差异。综上所述,本研究成功构建了结核分枝杆菌Rv1419DNA疫苗,即pVAX1-Rv1419重组质粒,并且证明此疫苗有较强的免疫原性,主要刺激Thl型细胞介导的免疫应答,但比Ag85A DNA疫苗免疫原性弱,有待进一步研究其应用价值。