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三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我国重要的海水养殖经济蟹类,对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是致其死亡的主要病原。盐度是三疣梭子蟹养殖的重要环境因子,由于阴雨天气及大换水等常会导致养殖水体盐度急剧变化,使得三疣梭子蟹产生应激反应,生理代谢紊乱,免疫力下降,极易引起疾病的爆发,甚至大量死亡。几丁质酶(Chitinase)是一种广泛存在于节肢动物体内,参与机体蜕皮生长、变态发育及免疫应答等生理过程的关键酶类,可通过裂解几丁质(Chitin)而发挥多种功能。节肢动物几丁质酶属于18-糖苷键水解酶(GH18)多基因家族,目前大多研究集中在昆虫中,其成员被归类为8个组别(group1-8)。相比于昆虫,甲壳动物在该方面的研究相对滞后,目前仅发现7组几丁质酶基因。三疣梭子蟹几丁质酶基因研究刚刚起步,仅有PtCht3(Group 3)、PtCht(Group 7)和PtChti(Group 3)等几例,功能研究主要聚焦于蜕皮及盐度适应等。据此,本研究克隆了三疣梭子蟹几丁质酶基因家族的5个成员基因,并根据其结构特征进行归类;借助实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)实现对基因功能的初步鉴定;利用荧光原位杂交实验(Fluorescent in Situ Hybridization,FISH)、原核表达及抑菌实验进行基因免疫功能的验证;通过注射感染不同病原探究基因在响应盐度变化的免疫机制等,主要研究内容如下:1.三疣梭子蟹5种几丁质酶基因的克隆与序列分析本研究利用RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)克隆技术成功克隆5个几丁质酶基因,分别命名为PtCht-1,PtCht-2,PtCht4,PtCht6,PtCht8。其中,PtCht-1 cDNA全长为1910bp,ORF1749bp,共编码582个氨基酸,预测分子量(MW)为65.122 kDa,理论等电点(pI)为4.52;PtCht-2 cDNA全长为2422bp,ORF1851bp,共编码616个氨基酸,预测MW 69.122 kDa,pI 4.62;PtCht4 cDNA全长为1549bp,ORF1389bp,共编码462个氨基酸,预测MW 51.172kDa,pI 5.03;PtCht6 cDNA全长为2736bp,ORF 2103bp,共编码700个氨基酸,预测MW 76.603kDa,pI 6.29;PtCht8 cDNA全长为1973bp,ORF1599bp,共编码532个氨基酸,预测MW 59.867 kDa,pI 6.79。将三疣梭子蟹5个几丁质酶基因编码的氨基酸序列分别与其他物种几丁质酶基因编码的蛋白进行同源性比对分析,结果显示,PtCht-1氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)EsCht4的同源性最高,为65%,PtCht-2、PtCht4、PtCht6氨基酸序列均与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)SpCht4的同源性最高,分别为96%、100%和85%,PtCht8氨基酸序列与东亚飞蝗(Locusta migratoria)LmCht5的同源性最高,为98%。利用MEGA 6.0软件对三疣梭子蟹5个基因氨基酸序列进行系统进化分析,结果显示,甲壳类几丁质酶基因分为7组,其中PtCht-1和PtCht-2均属于Group4,PtCht4、PtCht6和PtCht8基因分别归类于Group6、Group5和Group1。本实验研究进一步丰富了三疣梭子蟹几丁质酶GH18基因家族的类别,为甲壳动物几丁质酶多基因家族功能研究奠定基础。2.三疣梭子蟹5种几丁质酶基因功能的初步鉴定甲壳动物几丁质酶的主要功能集中体现在参与蜕皮,肠道围食膜内几丁质类食物的消化和病原免疫调控。本实验利用RT-qPCR技术分析三疣梭子蟹几丁质酶基因PtCht-1,PtCht-2,PtCht4,PtCht6和PtCht8在9个组织(心脏、肝胰腺、血细胞、鳃、胃、肠、肌肉、眼柄和表皮)中的表达模式。结果显示,5个基因在9个组织中均有表达,其中,PtCht-1,PtCht-2和PtCht6在肝胰腺中的表达量最高,PtCht4在肠中的表达量最高,而PtCht8在表皮中的表达量最高。由此推测,PtCht-1,PtCht-2和PtCht6基因极可能作为免疫基因参与机体的病原防御,发挥免疫功能;PtCht4基因除了具有消化吸收食物中几丁质的功能外,还可能参与机体的免疫防御;PtCht8基因可能主要参与三疣梭子蟹的蜕皮发育,该结果为三疣梭子蟹几丁质酶基因功能的深入研究奠定坚实的基础。3.三疣梭子蟹几丁质酶基因的免疫功能验证本研究通过基因核苷酸序列设计合成PtCht-1,PtCht-2和PtCht6基因的FISH探针,将注射有WSSV和副溶血弧菌的染病三疣梭子蟹的肝胰腺组织制成石蜡包埋切片,染色后于荧光显微镜下拍照记录。结果显示,3个基因在三疣梭子蟹肝胰腺细胞的细胞质及细胞核中均有分布,且基因在感染病原后靠近管腔的位置呈明显聚集,与肝胰腺发挥免疫功能时转运泡的运动方向一致,表明PtCht-1、PtCht-2和PtCht6基因均可作为免疫基因参与三疣梭子蟹的病原防御。成功构建PtCht4基因的原核表达载体PtCht4-pET28a,进行蛋白诱导表达、分离纯化及复性,利用复性后不同浓度的PtCht4蛋白进行抑菌实验,结果显示,随着蛋白浓度的增高,抑菌率显著增加,且相同浓度的蛋白对副溶血弧菌的抑制率显著高于金黄色葡萄球菌,表明PtCht4对病原菌的增殖有显著的抑制效果,验证了该基因作为免疫基因参与机体免疫防御的推断。4.几丁质酶基因在盐度影响梭子蟹免疫中的功能研究盐度是三疣梭子蟹养殖的重要环境因子,为了研究PtCht-1、PtCht-2、PtCht4和PtCht6基因是否在低盐度影响三疣梭子蟹免疫力中具有一定的作用,我们设置了低盐(72h半致死盐度11)胁迫下的病原感染实验。发现在低盐胁迫条件下,PtCht-1、PtCht-2和PtCht6的表达量在48h前的肝胰腺和血细胞中主要为显著下调(P<0.05),而PtCht4的表达量在72h前的肝胰腺中均为显著下调(P<0.05),最高下调了73倍。在低盐胁迫下注射WSSV后,PtCht-1在肝胰腺、血细胞中的表达量均于72h达到峰值,PtCht-2、PtCht4和PtCht6均于24h、72h达到峰值,PtCht-1比正常情况下感染WSSV的肝胰腺中达到峰值的时间最高延迟了24h,PtCht-2和PtCht4均比正常情况下感染WSSV的血细胞中达到峰值的时间最高延迟了69h,而PtCht6全部比正常情况下感染WSSV的肝胰腺和血细胞中达到峰值的时间最高低迟了12h。在低盐胁迫下注射副溶血弧菌后,由于其对三疣梭子蟹的强致死性,与正常情况下感染同样浓度的副溶血弧菌的蟹(72h全部死亡)相比,单位时间内死亡率显著提高(P<0.05)。研究结果预示着低盐胁迫可能抑制或延后几丁质酶等免疫基因的正常表达,从而导致机体免疫力下降。本实验的研究结果为更加深入地了解甲壳动物几丁质酶的免疫功能提供了数据参考。