弗托氏氧化葡萄糖酸杆菌转化乙二醇生成羟基乙酸工艺条件研究

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羟基乙酸(Glycolic acid,简称GA),是脂肪族中分子结构最简单的酸,自然界中含量较少,存在于柠檬、甜菜、甘蔗等植物中,羟基乙酸及其衍生物在化工、医药、食品等方面均有广泛的用途。实验中使用高效液相色谱仪建立了一个同时检测底物乙二醇和产物羟基乙酸的方法。利用磺化的苯乙烯-二乙烯共聚物作为填充物的Bio Rad Aminex HPX-87H离子色谱柱为分析柱,配合高效液相色谱仪的示差折光检测器和紫外检测器,达到了同时检测乙二醇和羟基乙酸的目的。经过不同色谱条件对比,选择了2 mmol/L的H2SO4作为流动相,柱温30℃,检测波长210 nm,流速0.6 m L/min,进样量20μL。乙二醇和羟基乙酸的检测线性范围为0.01~2 g/L,线性范围内相关性系数R~2分别为0.9993和0.9996,线性结果较好。实验室条件下该方法检测范围大、具有较好的重复性及稳定性。本文对Gluconobacter frateurii HD924转化乙二醇生产羟基乙酸的工艺条件进行了研究。在实验中利用正交实验设计的方法优化了种子培养基的组成成分,确定了最优种子培养基成分组成(g/L):山梨醇10、酵母粉15、碳酸钙1.5;通过设计单因素实验、Plackett-Burman实验,筛选出对羟基乙酸产量影响较为显著的3个主要因素:山梨醇浓度、酵母粉浓度、乙二醇浓度。以此为基础,利用最陡爬坡法来探究实验过程中极值范围。后续通过响应面实验,对这三个主要因素来进行分析,探究主要因素之间是否存在交互作用,并求得实验最佳转化条件。结果表明,优化后的转化条件为:山梨醇浓度40.30g/L,酵母粉浓度36.90 g/L,碳酸钙浓度2.50 g/L,乙二醇浓度28.14 g/L,发酵温度30℃,p H 7,接种量10%(V/V),转速200 r/min,发酵时间48 h。在此优化条件下,HD924羟基乙酸产量达到21.04 g/L。与优化前相比,羟基乙酸转化率提高了28.25%,转化率达到了74.77%,生产强度达到了10.52 g/(L·d)。在摇瓶转化的基础上,进行了20 L发酵罐实验。通过分批补料来控制底物浓度,结合压缩空气提高供氧,流加酸碱来在线控制p H等方法,对发酵条件进行了优化,初始乙二醇浓度为28 g/L,搅拌速度400 r/min,通气量1.2 vvm,罐压0.05 Mpa,利用氢氧化钠控制p H于6,经过72 h的反应,羟基乙酸产量达到了45.83 g/L,生产强度达到了15.28 g/(L·d),比摇瓶发酵结果提高了45%。对羟基乙酸的提取工艺进行了初步探究,先通过离心法对发酵液中的细菌以及其他杂质进行初筛,后利用膜设备除去发酵液中残余的菌体蛋白以及其他小分子颗粒,使用活性炭来吸附发酵液中的色素,最后经过真空抽滤和重结晶,干燥后得到羟基乙酸精品。
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