研究背景和目的就目前整形美容的发展来看,自体脂肪移植已经广泛运用于美容整形和修复创伤导致的软组织缺损的修复,其发展历史可以追溯到19世纪。在1911年,Bruning被最先报道将自体脂肪注射到皮下用于软组织的填充。随着抽脂技术的不断成熟,自体脂肪组织容易获取,不在供区和受区留下瘢痕,且不产生免疫排除反应、不会引起交叉感染,所以自体脂肪组织可以作为一种理想的软组织填充剂。但是自体脂肪移植的临床应用受到移植脂肪存活率的限制,根据长时间的随访观察,移植脂肪最终的存活率为20-80%。在移植的早期,移植脂肪和受区之间尚未建立血供,脂肪组织只能靠周围组织渗出的组织液提供营养,渗出距离仅为100-200μm。此时移植脂肪处于急性缺氧缺血的状态,移植脂肪中央区出现大量脂肪的坏死,随后坏死的脂肪组织被纤维结缔组织取代。由此可见,在自体脂肪移植中,在移植后的早期及时、充分的血供建立,对于移植脂肪的存活是非常重要的。目前细胞疗法被应用于自体脂肪移植,特别是脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stem cells, ASCs)辅助自体脂肪游离移植。Yoshimura等人研究细胞辅助的脂肪移植,他们将包含有ASCs的血管基质片段混合脂肪一起移植,发现细胞辅助移植比对照组存活率高。本课题组前期的研究也表明,ASCs混合脂肪移植可促进再血管化,从而提高移植脂肪的存活率。目前为止,ASCs辅助自体脂肪游离移植,被证实可以有效的提高移植脂肪的存活率。但是ASCs在脂肪移植中究竟发挥了怎样的作用,是通过什么机制促进游离脂肪的存活,这些问题都没有明确的答案。本实验围绕以下几个科学问题展开：(1)ASCs辅助自体脂肪游离移植,在形态学方面移植的早期移植脂肪发生怎样的变化?(2)ASCs调控移植脂肪再血管化的主要机制?本实验首先针对单纯自体脂肪移植和ASCs辅助自体脂肪移植后早期不同时间点,通过检测移植脂肪的存活率和HE染色切片,对移植脂肪组织学的变化进行比较研究,再应用ELISA等技术来探讨ASCs调控移植脂肪再血管化、提高移植脂肪存活率的主要机制。方法1、ASCs的分离和培养将抽脂所得的脂肪用PBS反复冲洗3次,再用0.125%Ⅰ型胶原酶于370C水浴消化30min,期间反复震荡3次。用与胶原酶消化后的混悬液等体积的完全培养液(高糖DMEM+10%胎牛血清+1%双抗)终止消化,200目滤网过滤,1200g离心5min以去除悬浮的脂肪细胞、脂滴等,去上清。将细胞沉淀用lml的完全培养液重悬后,加入6倍体积的红细胞裂解液,混匀后室温下孵育6min,1200g/min离心5min,去上清,再以适量完全培养基重悬沉淀,接种于培养皿,再加入适量完全培养液,置于370℃、5%CO2孵箱培养。细胞每3天换一次培养,每周以1：3的比例传代。本实验用的ASCs均为第三代细胞。2、单纯自体脂肪游离移植和ASCs辅助自体脂肪游离移植的模型制备及移植脂肪存活的评价将24只裸鼠背部左、右侧随机分为A、B组(n=36),采用Coleman技术分别于A、B组裸鼠背部皮下移植含5×105个ASCs的脂肪0.5mL和脂肪0.5mL。移植后1、5、7、14、30、90d分别取6只裸鼠,取出移植脂肪组织,进行以下观测：(1)移植脂肪的大体观察；(2)移植脂肪的体积及存活率；(3)HE染色切片。3、ASCs调控移植脂肪再血管化的检测将各个时间点的两组移植脂肪进行一下指标的检测：(1)ELISA检测VEGF (vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)和HGF (hepatocyte growth factor,肝细胞生长因子)的表达；(2)统计学分析。4、统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,使用统计软件SPSS17.0进行数据处理。两组之间比较采用配对t检验；组内不同时间点的差异采用方差分析；完全随机设计资料的多样本均数比较采用LSD检验。结果1.移植后早期不同时间点两组移植脂肪存活率：A组：1天(63.67±4.97)%,4天(67.33±7.66)%,7天(74.67±4.13)%,14天(79.67+8.73)%,30天(64.33±7.53)%,90天(55.00±6.78)%；B组：1天(61.33±1.63)%,4天(65.00±4.86)%,7天(74.33±4.97)%,14天(80.17±8.64)%,30天(54.67±7.55)%,90天(42.67±6.77)%。移植后早期不同时间点两组采用配对t检验比较,在1-14天两组移植脂肪存活率没有显著性差异(P>0.05),在30天和90天A组存活率明显高于B组(P=0.001,P=0.006)移植后随着时间的变化两组均采用方差分析,发现1-14天两组移植脂肪存活率稍有增高的趋势,随后开始明显的下降(P<0.05)。2.移植后早期不同时间点两组移植脂肪组织学的变化：移植后一周内,两组移植脂肪组织中央区可见少量的空泡、囊腔样改变,脂肪细胞的数量和大小无明显变化。移植后两周,移植脂肪组织中央区可见更多的坏死脂肪细胞,融合成空泡,且脂肪细胞大小不一。脂肪细胞间距逐渐变宽,且有大量的有核细胞的浸润,此现象在移植后第14天最为明显。在移植后第4天,A组在移植脂肪的表面可见到有血管从移植脂肪组织的包膜长入,但这个现象B组在移植后第7天才出现。随着时间推移,移植物血管的数量逐渐增加,且血管向移植脂肪组织中央区生长,但A组血管数量明显多于B组。在移植后30天,两组移植脂肪中均出现不同程度的纤维化,B组较A组更为严重。3.①ELISA检测不同时间点VEGF表达：A组在移植后第4天,VEGF的表达达到高峰,并一直持续到第14天,随后开始下降；B组VEGF高峰出现的时间较A组晚,于第7天出现,随后逐渐下降。②ELISA检测不同时间点HGF表达：HGF的高表达在A、B组均出现在第7天,并维持到第14天,随后逐渐下降,A组表达量始终高于B组。讨论先天性或后天获得性软组织缺损的修复,是整形外科面临的非常重要的课题之一,目前被广泛应用的方法有人工合成材料的填充植入、真皮脂肪瓣的游离移植等。但以上方法均存在不同的缺点,如供区损伤、组织坏死、排斥反应、材料吸收等。自体脂肪组织移植具有易获取、无免疫排斥反应、供受区损伤小等特点,因此自体脂肪组织成为理想的软组织填充剂。然而,对于自体脂肪组织移植的远期的吸收率的报道尚不一致(20-80%),限制其在临床的广泛应用。因此,自体脂肪游离移植后,早期充分的血管建立对于保证移植脂肪组织高的存活率十分重要。移植后2周内两组移植脂肪组织存活率有增加,我们考虑是这时期大量的脂肪细胞坏死,释放出脂滴,组织水肿,大量有核细胞浸润,这些组织学上的变化会导致移植后早期脂肪组织体积的增加。在移植后的早期两组移植脂肪组织在大体观察及存活率上无统计学差异,这说明在自体脂肪游离移植后的早期,移植脂肪组织的变化主要是发生于组织结构而不是存活率。关于移植脂肪组织最终的转归,存在两种理论：一种是“宿主取代论”,另一种是“细胞存活论”。“宿主取代论”指的是宿主的组织细胞(可能是巨噬细胞)浸润,吞噬坏死脂肪细胞释放出的脂质,最终取代移植脂肪中的脂肪细胞。“细胞存活论”指的是脂肪移植后,移植脂肪组织中部分存活的细胞,长期存活。后一种理论被广泛接受。因此,大多数学者认为移植脂肪组织中存活脂肪细胞的数量与最终存活脂肪的体积相关,所以在纯化和最大化存活脂肪细胞的数目上做出了很多的努力。有研究指出,在距离移植脂肪组织边缘300微米以内的细胞(包括脂肪细胞和ASCs)基本均可以存活,这个区域称之为“存活区”。向内靠近的第二区域为“再生区域”,此区域组织的存活依赖于再血管化的程度以及与周围组织接触的情况。在这个区域内的脂肪细胞在移植后的第1天就死亡,但是ASCs可以存活下来分化为新的脂肪细胞代替死亡的脂肪细胞。最核心的区域为“坏死区域”,这个区域的脂肪细胞和ASCs均死亡,无脂肪再生的发生,坏死脂肪液化被吸收,由纤维结缔组织填充或形成钙化。研究表明在游离脂肪移植后的第4天,就可以观察到从宿主血管出现血管新生长入移植脂肪组织。这与我们的实验结果相一致,而且在移植后的2周内,相对于单纯脂肪移植组,ASCs辅助脂肪移植组的组织学观察显示出移植脂肪组织中更高的血管密度。我们还发现在移植脂肪组织中,新生血管越密集的区域,就有越多的炎症细胞浸润。这个现象可能与巨噬细胞的浸润存在相关关系,可能促进血管生成。另外有研究表明,在肿瘤组织中当巨噬细胞暴露在缺氧的环境下,巨噬细胞的表型可发生变化,并激活多种促增殖和血管生成细胞因子和酶的表达。两组移植脂肪组织存活率无统计学差异,但是在组织学上ASCs辅助脂肪移植组表现出更好的血管化,这可能跟ASCs的旁分泌机制相关。脂肪抽吸和注射的过程会对脂肪组织造成机械性的损伤,并且移植过程中以及移植后的缺血缺氧也会对脂肪组织造成损伤。在面对这样机械性损伤,或者缺血缺氧的环境中,ASCs可分泌多种促血管生成生长因子如VEGF、HGF以及bFGF等。在缺氧的环境下(2%O2),ASCs的细胞增殖能力和分泌促血管生成生长因子(如VEGF、 bFGF)的能力都显著提高。还有其他的研究也得出相似的结论,在缺血缺氧的环境中,促血管生成生长因子mRNA的表达增加了1.7-4.1倍。在Wistar大鼠的游离脂肪移植模型中,VEGF在间质单核细胞中的表达在移植后7天出现最高峰,随后逐渐下降。这与我们的研究结果相符合,ASCs辅助脂肪移植时ASCs可促进VEGF的分泌高峰提前到移植后第4天。在人脂肪组织受到机械性损伤后,在创伤愈合的早期,首先释放的是FGF-2、TGF-β以及PDGF等,在这些生长因子的表达量开始下降后,在损伤后的1周VEGF和HGF的分泌才逐渐增高。在损伤或者缺血缺氧的环境中,受损伤的组织释放出大量的FGF-2, FGF-2通过JNK信号通路刺激ASCs的增殖和分泌HGF。因此在我们的研究中,ASCs辅助脂肪移植组中HGF在移植后一直维持一个较高的分泌水平,可能是因为充足的外源性的ASCs在缺血缺氧的环境中释放大量的HGF,使得HGF在移植后的早期就维持在一个较高分泌水平。而单纯脂肪移植组HGF的分泌增多在移植后第14天,我们考虑可能是因为移植后受损伤的受区组织和脂肪组织先释放FGF-2,FGF-2再调控HGF分泌,使HGF的释放在移植一周后才开始增多。有研究证实,在体外缺血缺氧的条件下ASCs只能存活3天。在脂肪移植后的1周内大部分的ASCs会因为缺血缺氧而坏死。因此,ASCs通过旁分泌机制促血管生成的作用主要是发生在脂肪移植后2周内。结论1.在移植后的早期(2周内),单纯自体脂肪游离移植和ASCs辅助自体脂肪游离移植,两组移植脂肪组织学结构的差异并未在大体观和存活率上体现出来,移植后炎性细胞浸润和组织水肿导致移植脂肪的体积增加。2.ASCs辅助脂肪移植较单纯脂肪移植呈现出更好的再血管化,虽然在脂肪后的早期对移植脂肪的存活率并没有影响,但是对移植后30天移植脂肪的存活率产生明显影响。3.ASCs辅助脂肪移植的再血管化较单纯脂肪移植发生的早,且血管数量更多,后期移植脂肪较轻程度纤维化,ASCs通过旁分泌机制分泌细胞因子如VEGF、HGF促进移植脂肪的再血管化,抑制脂肪组织的纤维化。4. ASCs通过旁分泌机制促血管生成的作用主要是发生在脂肪移植后2周内。