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癌症又被称为恶性肿瘤,是一种因细胞异常增殖而引起的疾病,破坏人体的正常生理功能,已经严重威胁到人类的身体健康和生命安全,给人民带来了沉重的经济负担。目前癌症的临床治疗手段主要包括手术、化疗、放疗等,但也同时面临着耐药性、治疗效果不佳和预后不良等多种难题,因此寻找新的治疗药物和治疗策略显得更加迫在眉睫。铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属植物,是一种在我国药用历史悠久的名贵中药材,其含量最高的活性成分为多糖（DOPs）,主要由甘露糖和葡萄糖组成。研究表明甘露糖具有抑制肿瘤生长和促进细胞凋亡的作用,铁皮石斛多糖也被证实对多种类型的肿瘤细胞具有抑制增殖和促进凋亡作用,且不同分子量多糖之间的抗肿瘤活性存在明显差异。然而,主要由甘露糖组成的糖类物质,包括单糖、寡糖和不同分子量的多糖之间的抗肿瘤活性是否存在差异,尚未见相关报道。基于上述研究基础,本研究通过提取、氧化降解得到不同分子量的铁皮石斛多糖,以骨肉瘤U20S、Saos-2细胞为实验对象,探索比较甘露糖、甘露六糖和铁皮石斛多糖单独使用,以及联合传统抗肿瘤药物顺铂对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用,寻找效果最佳的抗骨肉瘤药物,研究其联合顺铂对细胞凋亡的影响,并利用分子生物学方法初步探索其作用机制。本研究的结果将会为今后铁皮石斛和糖类药物治疗肿瘤的发展提供一定的实验基础和研究思路。目的:研究比较甘露糖、甘露六糖和不同分子量的铁皮石斛多糖单独使用以及联合顺铂使用对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞的增殖和凋亡的影响,并探索其作用机制。方法:（1）以铁皮石斛药材的茎为原料,经过石油醚脱脂,80%乙醇除去小分子化合物后,采用水提醇沉法得到铁皮石斛粗多糖DOP122,经过Fe2+-Vc-H2O2法氧化降解得到不同分子量的降解片段DOP20、DOP8、DOP2,计算得率。（2）利用苯酚硫酸法测定铁皮石斛多糖中的多糖含量;Bradford法测定多糖的蛋白含量;高效凝胶渗透色谱（HPGPC）检测多糖的分子量;多糖的单糖组成通过PMP柱前衍生化法,采用高效液相色谱（HPLC）进行检测。（3）采用MTT法在24、48h作用下检测不同浓度（12.5、25、50、100、200 μg/mL）的甘露糖（M1）、甘露六糖（M6）、铁皮石斛多糖（DOP2、DOP8、DOP20、DOP122）对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞增殖活性的影响,为后续实验筛选适宜的给药浓度。（4）利用克隆形成实验检测 M1、M6、DOP2、DOP8、DOP20、DOP122（25 μ g/mL）对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞克隆能力的影响。（5）乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒检测M1、M6、DOP2、DOP8、DOP20、DOP122（100 μ g/mL）对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞乳酸生成量的影响。（6）MTT实验检测24、48h作用下DDP单独使用对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞增殖活性的影响;选择适宜的DDP浓度（10μ M）与M1、M6、DOP2、DOP8、DOP20、DOP122（100 μ g/mL）联合,检测干预24、48h后对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞增殖的影响,并选择效果最佳的糖类药物作为实验对象,用于后续与DDP联合的研究。（7）MTT 实验检测 10 μM DDP 与不同浓度的 DOP20（12.5、25、50、100、200 μg/mL）联合干预24h对UT20S和Saos-2细胞增殖的影响,利用Isobologram法评价DDP与DOP20联合的作用效果。（8）普通倒置显微镜以及Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察10 μ M DPP、100 μ g/mL DOP20单用及联合干预24h对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞形态的影响。（9）流式细胞术检测10μM DPP、100 μ g/mL DOP20单用及联合干预24h后对Annexin V-FITC/PI双染的骨肉瘤U20S和Saos-2细胞凋亡的影响。（10）蛋白质印迹实验检测10μM DPP、100μg/mL DOP20单用及联合干预24h对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞凋亡信号通路相关的P53、Bax、Bak、Bcl-2、Mcl-1、Caspase3、Cleaved caspase3、Caspase9、Cleaved caspase9、PARP、Cleaved PARP表达的影响。成果:（1）经过提取、降解得到了 4个铁皮石斛多糖片段DOP122、DOP20、DOP8、DOP2,其得率分别为 19.87%、82.57%、76.19%、54.17%;多糖含量依次为 70.73%、87.81%、84.82%、87.57%;蛋白含量依次为5.71%、3.32%、2.87%、4.03%;分子量依次为1224.54kDa、200.99kDa、80.32kDa、24.89kDa;单糖组成（甘露糖:葡萄糖）依次为 3.29:1、4.12:1、4.47:1、4.28:1。（2）M1、M6、DOP2、DOP8、DOP122对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞的增殖无明显影响,细胞存活率维持在80%以上,DOP20呈时间和浓度依赖性抑制细胞增殖。（3）DOP20可显著抑制骨肉瘤U20S和Saos-2细胞的克隆形成（P<0.01）,而M1、M6、DOP2、DOP8、DOP122 则无此作用。（4）M1、M6、DOP2、DOP8、DOP122对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞的乳酸生成量无明显影响（P>0.05）,DOP20可显著降低细胞的乳酸生成量（P<0.01）。（5）DOP8单用48h可显著抑制骨肉瘤U20S和Saos-2细胞的增殖活性（P<0.01）,但与DDP联用并无增效作用（P>0.05）;M6和DOP2仅在联合DDP 24h时显示有增强的抑制Saos-2细胞增殖的作用（P<0.05）;DOP20单用24、48h均可抑制U20S、Saos-2细胞的增殖活性（P<0.05或P<0.01）,当与DDP联合则表现出较DDP单药组强的抑制细胞增殖的作用（P<0.05或P<0.01）,其余糖类药物则无该作用。（6）DOP20联合DDP表现出浓度和时间依赖性抑制骨肉瘤细胞的增殖,并具有协同增效作用。（7）普通倒置显微镜下观察到与空白组的骨肉瘤U20S和Saos-2细胞相比,DOP20与DDP单药组的细胞有少许出现贴壁不牢、细胞皱缩的现象,有少量漂浮细胞,两药联合组效果则最为明显;Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察到的DOP20与DDP单药组细胞核可见较空白组稍强的蓝色荧光,并存在少量的致密浓染,DOP20与DDP联用组的细胞核出现固缩、破裂等现象,可见一些碎片状的致密浓染,细胞凋亡特征较DDP单药组明显。（8）与空白组相比,单用DOP20不能增加U20S细胞的总凋亡率（P>0.05）,但可增加Saos-2细胞的总凋亡率（P<0.01）,单用DDP及DOP20+DDP联合时均可显著升高U20S、Saos-2细胞的总凋亡率（P<0.01）,且DOP20+DDP联合组与DDP单药组相比具有显著性统计学意义（P<0.01）。（9）与空白组相比,DOP20+DDP联合能上调骨肉瘤U20S和Saos-2细胞中抑癌蛋白P53和促凋亡蛋白Bax、Bak的表达水平（P<0.01）,下调抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达水平（P<0.01）,上调凋亡启动子Cleaved caspase9/Caspase9、凋亡执行子Cleaved caspase3/Caspase3 和凋亡标志物 Cleaved PARP/PARP 的比例（P<0.01）,且DOP20+DDP联合组的作用效果不同程度地强于DDP单药组（P<0.05或P<0.01）。结论:本研究证实了在甘露糖、甘露六糖和不同分子量的铁皮石斛多糖中,分子量为200.99kDa的铁皮石斛多糖DOP20单独使用具有最佳的抑制骨肉瘤U20S和Saos-2细胞增殖的能力,其作用机制可能与阻碍细胞糖酵解有关,当其联合顺铂使用后可发挥协同抑制细胞增殖的作用,并通过线粒体途径增强诱导U20S和Saos-2细胞的凋亡。该结果初步说明在主要由甘露糖组成的糖类药物对骨肉瘤治疗的体外研究中,铁皮石斛多糖的效果优于甘露糖和甘露六糖,并且要寻找适宜的分子量或者分子量范围,而不是单一地使用粗多糖。