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玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus) Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病(S. scabies)自然衰退土壤中的一株拮抗菌。该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、瓜类白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea Poll)等多种重要的植物病原菌具有很强的抑制作用,有着良好的生防应用潜力。为了对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中一些功能性基因进行研究,对其进行遗传改造以期得到抗生素高产菌株,本研究建立了该生防菌的接合转移转化体系,并且进一步优化了接合转移条件,获得了较好的转化效果。分别以基因整合型质粒pSET152和基因破坏型质粒pKC1139为出发质粒,ET12567(pUZ8002,pSET152/ pKC1139 )为供体,玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63孢子和菌丝体为受体,选取MS、PDA、TSB琼脂培养基和燕麦培养基为不同的培养基进行接合转移试验。结果表明MS培养基为接合转移的最适培养基,经验证,已成功地将质粒pSET152/pKC1139转入到了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中。以孢子为受体时,孢子预萌发条件为50℃热激10 min,37℃温育2.5 h,转化效率是10-7~10-6;以菌丝体为受体时,转化效率是10-7~10-6,但菌丝培养过程中容易受到污染。另外,抗生素的覆盖时间对接合转移效率的影响较明显,16~18 h覆盖效果最好。所以最终选择转化体系为:玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63孢子50℃热激10 min,37℃温育2.5 h,抗生素覆盖时间为17 h。nsdA (negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是天蓝色链霉菌(S. coelicolor)中发现的与抗生素合成相关的负调控基因。根据天蓝色链霉菌A3(2)的序列设计引物扩增玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63菌株中的该基因,经测序和序列分析表明,由保守序列引物nsdA-2R和nsdA-2L克隆到的玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63菌株中的该基因800 bp片段与已知nsdA基因核苷酸保守区域序列同源性达到99 %,由全长序列扩增引物nsdAWZ–R和nsdAWZ–L克隆到的该基因包含一个完整的开放阅读框,共编码369个氨基酸,与变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)中的nsdA基因的核苷酸序列同源性达到100 %,氨基酸序列同源性达到99 %。该全长基因命名为nsdAmgh,并用斑点杂交法验证了PCR扩增结果的正确性。为进一步研究该基因在玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中的功能,利用基因破坏型质粒pKC1139构建了同源重组质粒pSRNA800(pKC1139::800bp nsdAmgh)和pSRNA2500(pKC1139::1.5 kb nsdAmgh::1.0 kb KmR)来阻断该负调控基因。将用于基因破坏型重组质粒pSRNA800和pSRNA2500转化ET12567(pUZ8002)获得接合转移供体菌ET12567(pUZ8002,pSRNA800/pSRNA2500),通过接合转移导入玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中,均得到阳性转化子。转化子在高温和抗生素双重筛选压力下,玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 (pSRNA800)未得到基因中断突变株,而玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 (pSRNA2500)筛选得到表型为AmSKmR的nsdAmgh基因中断突变株,并用斑点杂交法验证了突变株中nsdAmgh基因已被正确中断。与出发菌株相比,阻断株在摇瓶水平上对棉花黄萎病菌的抑制能力提高了一倍。