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背景和目的:骨质疏松的主要特征是是骨组织的微结构破坏,单位结构内骨量下降及骨的脆性增加。人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal cells,hBMSCs)的成骨分化对于骨骼生成十分重要,是目前骨质疏松发病机制和治疗的重点研究方向。新的证据表明,长链非编码RNA(long-noncoding RNA,lncRNA)在hBMSCs的成骨分化中发挥重要作用。MALAT1通常被认为是一种肿瘤相关lncRNA,它在间充质干细胞分化中的作用目前尚不清楚。1α,25-二羟维生素D3[1α,25-dihydroxyvitamin D3,1α,25(OH)2D3]和25-羟基维生素D3[25-hydroxyvitamin D3,25(OH)D3]可以刺激hBMSCs的成骨分化。25(OH)D3需要在细胞内由1α羟化酶(Cytochrome P450 27B1,1α-hydroxylase/CYP27B1)转化为1α,25(OH)2D3。因此,hBMSCs既是1α,25(OH)2D3合成的位置,也是1α,25(OH)2D3作用的靶点。Megalin是一种主要在肾小管上皮细胞表达的血清维生素D结合蛋白(D binding protein,DBP)的跨膜受体,其介导25(OH)D-DBP复合物的摄取。本课题拟从hBMSCs的成骨分化调控入手,旨在探讨MALAT1在hBMSCs成骨分化中的作用以及具体机制,并研究megalin在维生素D调节hBMSCs成骨分化过程中的作用以及具体机制。方法:1.收集临床行全髋关节置换患者的hBMSCs,分为骨质疏松组和非骨质疏松组,Real-time PCR检测两组MALAT1及miR-143的表达,并通过sh-RNA技术特异性敲减MALAT1表达并检测其对于hBMSCs成骨分化的影响。利用双荧光素酶报告基因实验验证MALAT1下游靶向结合的microRNA,以及microRNA靶向结合的mRNA。2.hBMSCs由手术后弃置的骨髓中原代提取,根据megalin表达的高低选取高表达megalin(hi-Meg)和低表达megalin(lo-Meg)的hBMSCs。通过RT-PCR进行基因学分析25(OH)D3和1α,25(OH)2D3的作用;通过ELISA试剂盒检测1α,25(OH)2D3的合成情况;通过碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性检测成骨分化情况;通过siRNA下调megalin的表达,分为si-Meg和si-Ctr,以进行进一步验证。结果:1.首先,我们发现骨质疏松患者hBMSCs的MALAT1的表达较低,而miR-143表达较高。hBMSCs成骨诱导后MALAT1表达增加,miR-143表达下降。我们用shRNA敲除MALAT1后,hBMSCs成骨分化显著降低,表明MALAT1是hBMSCs成骨分化的正向调节因子。此外,通过双荧光素酶报告分析,我们发现MALAT1可以直接结合miR-143,并负调控其表达。同样,miR-143可以直接与Osx 3’-UTR结合,从而抑制Osx的表达。在MALAT1过表达的hBMSCs中Osx表达增加,miR-143 mimic可以逆转其表达增加。此外,Osx沉默降低了miR-143抑制剂所导致的ALP、OCN和OPN的表达。2.Megalin在15例hBMSCs中均有不同程度的表达。在hi-Meg组,1α,25(OH)2D3(10 nM)和25(OH)D3(100 nM)均可以显著刺激成骨相关基因Runx2和ALP的表达,同时可以显著刺激ALP活性的增加(p<0.05);而在lo-Meg组,只有1α,25(OH)2D3可以(p<0.001)。在si-Ctr组,1α,25(OH)2D3和25(OH)D3均可以显著刺激成骨相关基因Runx2,ALP和BSP的表达,同时可以显著刺激ALP活性的增加(p<0.05);而在si-Meg组,只有1α,25(OH)2D3可以(p<0.05)。相似的,只有在si-Ctr组,25(OH)D3才能显著刺激CYP24A1的表达,而在si-Meg组25(OH)D3的效果不明显。同时,与相应的对照组相比,lo-Meg组(46%,p=0.034)和si-Meg组(23%,p<0.001)在存在25(OH)D3底物的情况下,1α,25(OH)2D3的合成明显较低。我们发现leptin在100 ng/mL浓度下可以显著提高lo-Meg组hBMSCs的megalin的表达。结论:综上所述,我们的研究提示MALAT1通过靶向miR-143来调节Osx的表达,进而促进hBMSCs的成骨分化。hBMSCs同样表达megalin,且megalin介导hBMSCs中1α,25(OH)2D3的合成和25(OH)D3-DBP复合物对hBMSCs的VDR激活及成骨分化。