不同于中医传统入药的桑枝,本课题研究的对象为桑树栽培品湖桑32(Morus alba L.var.multicaulis(Perrott.)Loud.)的一年生的枝皮,可用中药剥皮机取桑枝的表皮及韧皮部组织。近年来,桑枝皮被不断证实具有抗氧化、降血糖、降血脂等功效。本课题首先探索了桑枝皮的化学物质组成,然后建立了C57/6J小鼠的复杂糖尿病模型,进而用GC-MS平台对桑枝皮改善小鼠糖尿病的潜在机理进行非靶向代谢组学分析,同时还检测了桑枝皮对小鼠的脾淋巴细胞组成及胞内炎症因子的影响,并选取了潜在作用靶点Fox O1进行了蛋白和基因水平的验证。本课题的研究主要涉及的内容具体如下:(1)高分辨质谱检测湖桑枝皮中化合物,并解析了桑皮多糖结构。桑枝皮中含有氨基酸类、多糖、维生素、有机酸、黄酮、生物碱、甾体、苯丙素及香豆素类等物质:多种特色氨基酸及衍生物、二肽等,如苏氨酸、O-磷酸-L-苏氨酸;单糖、双糖、寡糖都有;多种营养物质如肌醇,维生素A、B、D等;多种异戊烯基、酚羟基、甲氧基取代的黄酮、黄酮醇、查尔酮、异黄酮、黄烷醇、花色苷等化合物;含N-杂环类生物碱如1-脱氧野尻霉素及其衍生物、莨菪亭、打碗花素等;甾类化合物如菜油甾醇、桦木酸、异麦角甾醇等;常见的小分子有机酸和脂肪酸如酒石酸、绿原酸、棕榈酸,以及富含酚羟基的酸性化合物,如白藜芦醇、氧化白藜芦醇等;有如七叶亭、姜黄素等苯丙素类化合物,如芹菜素、阿魏酰基香豆素等香豆素类化合物;此外还有其他含苯骈呋喃(酮)、苯骈吡喃(酮)、二苯乙烯等结构类的化合物等。从桑枝皮中分离得到两个多糖。基本组成由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸构成,主链分别由(1→3)连接的葡萄糖,(1→3)连接的鼠李糖和(1→2,4)连接的木糖组成。(2)建立胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗共存的糖尿病小鼠模型。通过对C57/6J小鼠注射链脲佐菌素(STZ)和高脂高糖饮食联合诱导,模拟临床上的复杂型糖尿病。(3)非靶向血清代谢组学揭示桑枝皮治疗糖尿病的生化机理采用三种不同剂量的桑枝皮粉添食喂养糖尿病模型小鼠。基于GC-MS的代谢组学方法对小鼠血清样品中的代谢产物进行分析,并辅以生化评价、组织病理学检查和酶蛋白检测进行验证。通过对内源性代谢物的差异分析和生物学功能富集分析,发现模型组小鼠出现代谢紊乱,包括:山梨醇途径的激活和半乳糖代谢的增强、糖异生途径、脂肪酸氧化途径、蛋白质分解途径增强;戊糖磷酸途径、糖酵解途径和有氧氧化途径活性减弱、胆固醇的合成,肌醇的生成在糖尿病模型组也减弱。与模型小鼠相比,这些异常的代谢变化在桑枝皮喂食治疗组都得到了缓解,并且呈现出剂量效应。更细致的说,发现桑枝皮通过提高肌醇含量而促进了葡萄糖代谢;加强磷酸戊糖途径提供NADPH,从物质水平上能缓解机体的氧化应激;抑制肉碱棕榈酰转移酶I的活性,促使脂肪酸氧化水平降低,酮体生成减少。综合来看,桑枝皮的喂食提高了模型小鼠的糖代谢水平,从而使得对脂代谢和蛋白质代谢的能量需求减少,减轻了机体的氧化应激,改变了过多NADH和过少的ATP对三羧酸循环的不合理调控的状态,使得能量代谢趋于正常。(4)桑枝皮对糖尿病模型小鼠炎症细胞和因子的影响糖尿病模型小鼠的免疫器官脾中的淋巴细胞组成和比例与正常组相比,发生了一定变化,其CD3~+T细胞略微增加,CD4~+/CD8~+的比值减少,B细胞比例降低,NK细胞也有轻微下降。桑枝皮粉末的治疗一定程度抑制了这些变化。促炎症因子NF-κB p65、IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平在模型组升高,这提示模型组小鼠存在系统性炎症。桑枝皮治疗组的促炎症因子的表达降低,说明桑枝皮对糖尿病模型小鼠的炎症有改善作用。(5)发现并验证基因靶点Fox O1在桑枝皮的干预中的变化选取控制糖代谢的上游靶点Fox O1,以链脲佐菌素(STZ)注射损伤小鼠胰腺为动物模型,检测桑枝皮对模型小鼠的影响。结果表明,给小鼠喂食桑枝皮,可以减轻STZ诱导的胰腺β细胞功能障碍和损伤,具有改善糖代谢的作用。在PI3K/AKT/Fox O1信号途径中,通过激活AKT、抑制Fox O1参与桑枝皮的保护作用。Fox O1从细胞核到细胞质的易位增强,核内Fox O1基因靶点被抑制。同时,在模型组小鼠胰腺和肝脏中,PI3K、PDK1、AKT和Fox O1的基因表达较低,桑枝皮可增加PI3K、PDK1、AKT和Fox O1的基因表达。本课题以湖桑32的桑枝皮为材料,工作的创新性主要表现在快速全面检测了其化学组成;运用血清代谢组学,阐明了桑枝皮改善糖尿病小鼠的生化水平上的机理。选取了控制糖代谢的一个上游靶点Fox O1分析。确认了桑枝皮对糖尿病炎症的系统改善作用。本研究结果对桑枝皮降血糖,改善糖尿病的分子作用机理深入研究,后续工作可将不断依循代谢物变化的线索探索至靶蛋白和基因水平。免疫细胞CD4~+T细胞和CD8~+T细胞及有关炎症因子的变化也表明更细一步的炎症细胞亚型变化也是值得探讨的工作。本课题也为蚕桑可持续发展、扩大桑树的药用资源,更充分综合利用蚕丝业废弃物-桑枝条提供了重要的实验依据。