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造血干细胞可以产生所有谱系的血液细胞,它主要存在于骨髓内,骨髓壁龛可以为其提供静息、增殖和分化所必需的调节信号。骨髓基质细胞是骨髓的主要成分,越来越多的证据表明它是造血干细胞的“沉默伴侣”,可以分泌多种造血过程中所需的正负调控因子,发挥高效的调控作用,另一方面它也能为造血干细胞的增殖、分化与成熟构筑良好的空间环境。它还可以分泌生长因子以促进克隆细胞生存、招募内皮细胞及间充质干细胞。黑色素瘤细胞黏附分子(MCAM)被认为是骨髓壁龛的标志物,也是骨髓基质细胞命运的决策者。糖基化是存在较为广泛的蛋白翻译后修饰之一,与蛋白的表达、定位和半衰期密切相关,还影响细胞的增殖或凋亡等。糖链由糖基转移酶和糖苷酶共同作用产生。其中,N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III(MGAT3)负责将N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的β-1,4糖苷键连接到N-聚糖上的β-甘露糖上,形成平分型GlcNAc结构。平分型GlcNAc可以抑制细胞之间以及细胞与胞外基质之间的黏附从而抑制肿瘤转移,但其对于骨髓微环境以及其中的克隆细胞的影响尚未有深入研究。骨髓基质细胞与恶性克隆细胞共培养的模型,常被用于研究骨髓微环境中基质细胞与恶性克隆细胞之间的相互作用。前期数据表明,基质细胞HS27a和HS5中MGAT3和MCAM的表达差异显著:HS27a细胞中MGAT3表达较低但MCAM表达非常高,相反的,HS5细胞中MGAT3表达较高但MCAM几乎不表达。课题组前期发现,在HS5中过表达MCAM可以促进恶性克隆细胞的增殖,而在HS27a中干扰MCAM可以抑制恶性克隆细胞的增殖。本论文首先对MDS临床样本数据进行分析,结果显示MDS病人骨髓基质细胞中MGAT3的表达较对照组显著降低。另一方面,恶性克隆细胞可以抑制骨髓基质细胞中平分型GlcNAc的表达。由此推测,平分型GlcNAc在骨髓微环境中发挥重要的作用。本文对平分型GlcNAc在骨髓微环境中发挥的功能和具体机制进行了研究。当HS27a细胞中过表达MGAT3(HS27a-MGAT3)时可以抑制恶性克隆细胞的增殖,而在HS5细胞中干扰MGAT3(HS5-sh MGAT3)时可以促进恶性克隆细胞的增殖。另外,在HS27a细胞中过表达MGAT3会导致MCAM的下调表达,而在HS5细胞中干扰MGAT3可以导致MCAM的上调表达。通过在HS27a中构建多西环素调控MGAT3表达的细胞株(HS27a-Tet One-MGAT3),提取小鼠骨髓的间充质干细胞(MSC)并构建其过表达MGAT3的细胞株(MSC-MGAT3)和干扰MGAT3的细胞株(MSCsh MGAT3),发现在HS27a-Tet One-MGAT3中,加入多西环素诱导MGAT3逐渐过表达之后,MCAM表达含量呈逐渐下调,MSC-MGAT3中MCAM表达含量下调,MSCsh MGAT3中MCAM表达含量上调,这些结果都证明MGAT3与MCAM的表达相反。免疫共沉淀实验及质谱结果表明MCAM上存在平分型GlcNAc的修饰,修饰位点发生在肽段序列QGNLS的N上。生物素标记膜蛋白的实验显示在HS27a细胞中过表达MGAT3后MCAM总蛋白表达含量下调,但是细胞质中MCAM表达含量上调,细胞膜上MCAM表达含量下调。并且当HS27a细胞中过表达MGAT3之后,MCAM与高尔基体和溶酶体明显共定位,提示细胞中过表达MGAT3可能使MCAM无法成为成熟的膜蛋白被翻转至膜外,从而导致MCAM在膜内被溶酶体降解。最后利用小鼠模型发现,HS27a细胞中过表达MGAT3可以抑制KG1a在小鼠脾脏中的增殖并且延长该组小鼠的生存期。以上结果表明,MGAT3及其表达的平分型GlcNAc在骨髓微环境中发挥重要功能。MGAT3可能通过影响骨髓壁龛标志物MCAM的表达,进一步影响髓系恶性克隆细胞的增殖。