研究背景：　　 随着人口老龄化程度的加剧,脑血管疾病已成为一个倍受社会关注的问题。慢性脑缺血是脑血管疾病主要病理基础,严重危害人类的健康。据统计中老年人群中有2/3的人患有慢性脑供血不足,属中老年人多发病。慢性脑缺血是脑灌流动脉狭窄或闭塞所引起的一种很常见的缺血性脑血管疾病。临床表现主要为头晕、头痛、失眠、肢体麻木、记忆力减退、情绪低落等,反复发作,时轻时重、无神经系统局灶性定位体征为其主要特点。　　 针对慢性脑缺血最明显的早发症状之一是学习记忆减退,目前大量实验研究主要集中在模型动物的行为学,皮质、海马区组织形态学、神经生化学、脑血流等指标的研究领域上。各种慢性脑缺血模型用迷宫试验研究大鼠的行为学改变,提示慢性脑缺血损害大鼠的学习记忆能力。海马是哺乳动物完成学习和记忆活动的关键结构,海马也是脑缺血最敏感的区域,是脑内参与记忆储存功能的重要部分。谷氨酸在学习和记忆及神经元可塑件方面均起重要作用,N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-Methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)是谷氨酸的配基和电压双门控离子通道,主要分布在突触后膜；它在中枢神经系统具有特殊的双面性,生理上与学习记忆的形成密切相关。NR2B亚基被命名为“聪明基因”,提出该基因就是记忆基因的论断。　　 中医学没有慢性脑供血不足病名,但“眩晕”、“头痛”、“失眠”、“健忘”等归属此病。历代医家有“无虚不作眩”、“无瘀不作眩”之说。其病位在脑,以虚为本,由于病程迁延,往往多因兼见,虚实并存。“乌龙丹”系国家级名老中医臧堃堂教授临床经验方,该方以补肾填精,健脾化痰,活血通络立法:在临床上常用于治疗缺血性脑病,效果显著。我们课题组早期的实验研究表明,“乌龙丹”有多方面的药理作用,能从不同途径改善脑缺血后的病理变化；并能改善多发性脑梗塞痴呆大鼠学习记忆的功能,但针对乌龙丹防治慢性脑供血不足致学习记忆减退的作用及其机理尚未进行研究。　　 目的：　　 本研究通过复制慢性脑缺血模型,探讨慢性脑缺血后学习记忆功能的变化及“乌龙丹”的作用,揭示慢性脑缺血与认知障碍的关系,为“乌龙丹”临床防治慢性脑供血不足及相关疾病提供实验依据。　　 方法:　　 1、受试药物　　 乌龙丹　　 2、动物模型制作及分组　　 采用永久性结扎大鼠双侧颈总动脉制作慢性脑缺血大鼠模型。假手术组只分离双侧颈总动脉,不结扎,其余处理同手术组。大鼠造模后3周,存活大鼠采用随机数字表法分组。实验5组,每组17只,分别是假手术组、模型组、乌龙丹高剂量组、乌龙丹低剂量组、银杏叶组。乌龙丹高剂量组(相当于生药量8.8g/kg.d)、乌龙丹低剂量组(相当于生药量4.4 g/kg.d)、银杏叶组(约含总黄酮醇苷460 mg/kg.d),假手术组和模型组灌服等量生理盐水。每日灌胃1次,连续5周。　　 3、观察指标:　　 3.1大鼠Morris水迷宫定向航行实验搜索策略的变化　　 3.2大鼠Morris水迷宫定向航行实验逃避潜伏期的观测　　 3.3大鼠Morris水迷宫空间搜索能力的变化　　 3.4大鼠避暗实验潜伏期时间和错误次数观测　　 3.5大鼠皮层血流量的测定　　 3.6大鼠海马组织病理形态学观察及CA1区神经元密度比较　　 3.7 NR1/NR2B在大鼠海马及皮层中的表达　　 4.统计学分析　　 采用SPSS13.0统计软件。实验数据采用均数±标准差((x)±s)表示,结果比较运用重复测量方差分析,单因素方差分析(One-way ANOVA),组间多重比较方差齐时用LSD方法,不齐时用Dunnetts T3。P<0.05为差异有统计学意义。　　 5.结果:　　 5.1乌龙丹对慢性脑缺血大鼠Morris水迷宫定向航行实验搜索策略的影响　　 在最初的训练中,大鼠寻找平台的搜索策略主要是边缘式和随机式；随着训练次数增加除模型组动物仍有大部分保持此搜索策略外,假手术、银杏叶组及乌龙丹高、低剂量组均主要以直线式和趋向式。　　 5.2乌龙丹对慢性脑缺血大鼠Morris水迷宫定向航行实验逃避潜伏期的影响　　 各组大鼠在5 d训练过程中寻找平台潜伏期,随着训练时间增加,潜伏期越来越短,表明大鼠在训练过程中已逐渐学会寻找平台。采用重复测量和单因素方差分析,时间点和组别之间有交互效应(F=2.096,P=0.031)；组别之间有主效应(F=7.403,P=0.000)；各时间点间有主效应(F=906.786,P=0.000),需进行两两比较。结果表明,与模型组比较,乌龙丹高、低剂量组和银杏叶组均能缩短潜伏期时间,且第3天～5天潜伏期时间有显著性意义(P<0.05)。　　 5.3乌龙丹对慢性脑缺血大鼠Morris水迷宫空间搜索能力的影响　　 各组大鼠在原平台停留时间经One-way ANOVA分析组间有显著性差异(F=7.245,P=0.000)；各组大鼠穿越原平台象限路程经One-way ANOVA分析组间也有显著性差异(F=11.635,P=0.000)；需进一步两两比较。结果:假手术组、乌龙丹高、低剂量组及银杏叶组在原平台象限停留时间和穿越原平台象限路程均多于模型组(P<0.01)。假手术组与乌龙丹低剂量组和银杏叶组比较,原平台象限停留时间增多、穿越原平台路程增多,差异具有统计学意义(P<0.01),但与乌龙丹高剂量组比较,无明显差异(P=0.112)。　　 5.4大鼠避暗实验　　 各组大鼠潜伏期时间经One-way ANOVA分析组间有显著性差异(F=6.858,P=0.000)；各组大鼠错误次数经One-way ANOVA分析组间也有显著性差异(F=24.795,P=0.000)；需进一步两两比较。结果:模型组与假手术组比较,潜伏期明显缩短(P<0.01),错误次数明显增加(P<0.01)；银杏叶组和乌龙丹高、低剂量组与模型组比较差异显著(P<0.01),潜伏期延长,错误次数减少。　　 5.5大鼠皮层血流量的测定　　 各组大鼠皮层血流量数据经One-way ANOVA分析组间有显著性差异(F/welch=19.384,P=0.000),需进一步两两比较(采用LSD法)。结果:假手术组、乌龙丹高、低剂量组及银杏叶组的大鼠皮层rCBF均高于模型组,差异具有显著性(P<0.01)；但乌龙丹高、低剂量组及银杏叶组的大鼠皮层血流均低于假手术组,差异也具有显著性(P<0.01)。　　 5.6脑组织海马CA1区神经元组织病理形态学观察　　 HE染色后假手术组大鼠海马CA1区神经元形态规则,层次丰富,神经元细胞排列整齐密集、细胞间隙正常,细胞轮廓清楚,核居中,细胞突起清晰可见；模型组大鼠海马CA1区细胞层数不完整,神经元排列紊乱、松散,细胞间隙明显,核固缩过半,细胞间隙水肿,可见明显凝固性坏死和细胞脱失；乌龙丹高剂量组海马CA1区与假手术组比较,除外层神经元细胞有部分脱失和核固缩外,其余无明显差异；乌龙丹低剂量组和银杏叶片组海马CA1区神经元形态介于乌龙丹高剂量组和模型组之间,可明显减轻模型组海马神经元细胞脱失现象。　　 神经元密度观察:各组大鼠神经元密度数据经One-way ANOVA分析组间有显著性差异(F=160.545,P=0.001),需经一步两两比较(采用LSD法)。结果:各组与模型组比较,海马CA1区神经元密度均大于模型组(P<0.001),而各组和假手术组比较也存在显著差异(P<0.001)。　　 尼氏染色结果发现,假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞排列整齐规则,胞浆染色清晰且虎斑丰富,胞核淡染；但模型组大鼠海马CA1区神经元细胞排列散乱,神经元胞体肿胀,核固缩、凝聚,胞浆内虎斑明显减少,提示尼氏小体大量溶解；各给药组神经元病变均轻于模型组,可见部分神经元细胞和尼氏小体减少,乌龙丹高剂量组改善最为明显,仅有少量神经元细胞减少；银杏叶片组次之,乌龙丹低剂量组仍见神经元细胞损伤,胞浆内虎斑减少,尼氏小体含量降低。　　 5.7大鼠皮层及海马NR1、NR2B的表达　　 NR1在各组大鼠皮层及海马的表达水平的比值经One-way ANOVA分析组间有显著性差异(F=466.237,P=0.000；F/Welch=718.233,P=0.000)；NR2B在各组大鼠皮层及海马的表达水平的比值经One-way ANOVA分析组间也有显著性差异(F/Welch=591.984,P=0.000；F=398.379,P=0.000),需经一步两两比较(采用LSD法)。结果:模型组皮层及海马NR1、NR2B表达水平与假手术组比较,比值显著降低(P<0.001)。乌龙丹高剂量组和银杏叶组皮层及海马与模型组比较NR1、NR2B表达均增高(P<0.001)；但与假手术组比较,NR1、NR2B表达水平比值降低,差异也具有统计学意义(P<0.01)。乌龙丹高剂量组与银杏叶组比较,皮层及海马NR1、NR2B表达水平比值也增高(P<0.001),差异具有统计学意义。　　 结论:　　 1.乌龙丹能改善慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力。　　 2.乌龙丹改善慢性脑缺血大鼠的学习记忆功能途径之一:增加大鼠脑皮层血流。　　 3.乌龙丹改善慢性脑缺血大鼠的学习记忆功能途径之一:保护大鼠海马神经元,减少神经元细胞的丢失。　　 4.乌龙丹改善慢性脑缺血大鼠的学习记忆功能途径之一:提高海马和皮层区NR1、NR2B的表达水平。