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聚羟基烷酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是许多细菌和古菌细胞内存在的生物聚酯，是一类天然的可降解高分子材料。3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯[Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate，(PHBV)]属于短链PHA，具有较为优良的材料学性质。目前PHBV工业生产上使用的菌株需要同时利用葡萄糖和丙酸（或戊酸）作为碳源合成高3HV含量的PHBV，生产成本较高。 本文对PHBV生产菌株Ralstonia eutropha Rem-1进行基因组测序、基因注释和比较基因组分析，着重分析了己糖转运系统、PHBV合成途径和丙酰辅酶A代谢途径。对Rem-1进行代谢工程改造，提高其直接利用葡萄糖合成PHBV的能力。首先对Rem-1进行了全基因组的从头测序，组装得到24个Scaffolds，1021个Contigs。获得了Rem-1基因组的精细图信息。以R.eutrophaH16的基因组作为参考序列，对Rem-1基因组进行了基因组的比较分析。与H16基因组比对的SNP分析表明，Rem-1的1号染色体有977个突变点，2号染色体有1279个突变点，质粒pHG1有699个突变点。Rem-1与己糖磷酸转移酶系统相关的基因中，编码跨膜转运蛋白EIIBC组分的nagE基因发生了突变，第790位碱基从鸟嘌呤突变成胞嘧啶，从而使糖转运蛋白NagE的第264位的甘氨酸(G)突变成精氨酸(R)。推测由于这一突变，使Rem-1的糖转运蛋白NagE扩大了糖底物利用范围，也可以利用葡萄糖。表型及生长分析结果表明，在R.eutrophaH16中表达突变后的nagE基因，使H16菌株获得了利用与Rem-1相同的性状。Rem-1 PHBV合成途径的三个关键酶基因PhaA、Pha和PhaC均未发生突变，PHBV分解途径相关的解聚酶中只有phaZ6的序列不完整，其它均与H16一致。进一步分析了菌株Rem-1中2-甲基柠檬酸循环（2-methylcitric acid cycle，2-MCC）以及甲基丙二酸单酰辅酶A的代谢途径。2-甲基柠檬酸循环是丙酰辅酶A分解代谢的重要途径之一，在Rem-1中该途径是完整的。甲基丙二酸单酰辅酶A的代谢途径将三羧酸循环的中间代谢物琥珀酰辅酶A与丙酰辅酶A的合成相关联。丙酰辅酶A是3HV合成的前体化合物。而2-MCC是丙酰辅酶A分解代谢的重要途径之一，与3HV合成途径竞争底物丙酰辅酶A。本工作以Rem-1基因组数据为基础，敲除Rem-12-MCC途径中关键的2-甲基柠檬酸合成酶基因prpC1和 prpC2，分别获得了prpC1敲除菌株Rem-3和prpC2敲除菌株Rem-5以及prpC1和prpC2双基因敲除菌株Rem-7。发酵实验结果表明，Rem-3，Rem-5和Rem-7均能直接利用葡萄糖合成PHBV，不需要补加丙酸，细胞干重、PHBV产量和PHBV含量相近，均比出发菌株Rem-1略有下降。但Rem-3，Rem-5和Rem-7合成的PHBV中3HV组分的含量与Rem-1(0.33 mol％)相比均有所提高。Rem-3的3HV含量为0.52 mol％，Rem-5的3HV含量为0.41 mol％，prpC1敲除相比prpC2敲除对3HV合成的影响要略大一些。prpC1和prpC2双敲除对菌株3HV合成有明显影响，Rem-7的3HV含量达到1.33mol％，比Rem-1提高了3倍。增强细胞内丙酰辅酶A合成的代谢流量，可以为3HV的合成提供更多的前体物。为此，将E.coli W3110的甲基丙二酸单酰辅酶A代谢途径引入Rem-1。克隆了E.coli W3110的sbm-ygfD-ygfG基因簇，将其置于R.eutrophaH16的phaCAB的启动子PphaC1控制之下，构建了表达质粒pMwf,转化Rem-1，得到重组菌株Rem-2。对Rem-2的粗酶液进行分析表明，外源基因簇sbm-ygfD-ygfG中sbm编码的甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的比活为3.9U/mg蛋白，ygfG编码的甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的比活为2.5U/mg蛋白。发酵实验表明Rem-2能利用葡萄糖合成PHBV，3HV的含量达到8.5mol％，比Rem-1提高了24倍。综合阻断细胞内丙酰辅酶A代谢旁路与增强丙酰辅酶A内源合成两种策略，我们进一步将表达质粒pMwf分别转化prpC1和prpC2敲除菌株Rem-3，Rem-5和Rem-7，构建了菌株Rem-4，Rem-6和Rem-8。摇瓶发酵结果表明，Rem-6和Rem-8的生物量分别为14.40 g/L和13.45 g/L，与Rem-2(13.47 g/L)基本相当，Rem-4的生物量略有下降，为11.90g/L。Rem-4、Rem-6和Rem-8的PHBV产量比Rem-2(8g/L)分别提高了14.6％，9.6％和19.6％; PHBV含量分别提高了29.8％，2.6％和19.9％。各菌株的3HV含量表现出较大差异，与Rem-2相比，Rem-6下降了25.9％，而Rem-4提高了76.4％，Rem-8则提高了2.4倍。Rem-8的3HV含量达到29mol％,比Rem-1提高了87倍，比Rem-2提高了3倍。在7.5升发酵罐上比较了Rem-2和Rem-8的性能，结果表明，Rem-2细胞干重为151g/L,PHBV产量为94.4g/L，PHBV含量为62.5％，3HV的含量达到4.8 mol％;Rem-8细胞干重为132.8g/L，PHBV产量为91.1g/L， PHBV含量为68.6％，3HV的含量达到26.0 mol％。通过对出发菌株Rem-1的代谢工程改造，获得了7株重组菌，发酵性能均得到不同程度改善。其中Rem-8的性能最佳，3HV组分的含量比Rem-1提高了87倍。