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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病,近年来患病人数逐年增加,已经成为重大的公共卫生问题。AD早期出现的昼夜节律紊乱可在一定程度上加重AD的其他症状如学习记忆与认知功能缺陷等,其在AD的发展过程中至关重要。大量研究证实,AD核心病理特征—脑组织中异常沉积的β淀粉样蛋白(Amyloid-βprotein,Aβ)与AD昼夜节律紊乱的发生密切相关。Bmal1作为昼夜节律的核心组分,在昼夜节律的调控和维持中发挥重要作用。我们课题组前期研究发现Aβ的核心片段Aβ31-35可诱导HT22海马神经细胞Bmal1异常表达。然而,针对Aβ31-35所致Bmal1异常表达目前尚无有效的防治措施。2型糖尿病(T2DM)和AD在发病上具有相关性,胰岛素抵抗是T2DM和AD的共同病理生理特征。脂联素(Adiponectin,APN)是由脂肪细胞分泌的细胞因子,具有胰岛素敏化作用。临床研究表明,AD患者血清中脂联素水平降低。另有研究揭示,脂联素信号传导缺陷可诱导小鼠出现AD样病理改变,如Aβ沉积,Tau蛋白高度磷酸化,神经炎症等,而激活脂联素信号可改善APP/PS1 AD模型小鼠的记忆和认知缺陷,突触功能障碍等神经病理特征。然而,脂联素与AD昼夜节律紊乱的关系及脂联素是否具有改善Aβ31-35诱导的Bmal1异常表达的作用还有待明确。有研究发现Aβ异常沉积导致GSK3β活性增加,GSK3β活性的改变又可影响Bmal1的调控,而脂联素可以抑制GSK3β活性,但脂联素是否可通过抑制GSK3β活性改善Aβ31-35诱导的Bmal1异常表达目前尚不十分清楚。本研究旨在探讨脂联素能否改善Aβ31-35所致Bmal1异常表达,并进一步阐明GSK3β在脂联素改善Aβ31-35所致Bmal1异常表达中的作用。采用小鼠跑轮行为学实验、免疫组织化学染色、Real-time PCR及Western Blotting实验证实脂联素敲除小鼠存在Aβ沉积、昼夜节律紊乱及Bmal1基因/蛋白异常表达。在离体水平上,通过CCK8、Real-time PCR、和Western Blotting实验发现Aβ31-35引起HT22海马神经细胞Bmal1基因/蛋白异常表达及细胞存活率下降,脂联素预处理对Aβ31-35诱导的Bmal1基因/蛋白异常表达及细胞存活率下降具有改善作用。此外,Aβ31-35可以诱导HT22海马神经细胞GSK3β活性增加,GSK3β抑制剂LiCl预处理后可明显逆转Aβ31-35所致GSK3β活性增加,且显著改善Aβ31-35诱导的Bmal1基因/蛋白异常表达及细胞存活率下降,而脂联素可改善Aβ31-35诱导的HT22海马神经细胞GSK3β活性增加。由此我们认为GSK3β活性增加参与Aβ31-35诱导的Bmal1异常表达且脂联素可通过抑制GSK3β活性改善Aβ31-35诱导的Bmal1异常表达,这为AD患者昼夜节律紊乱的防治提供新的思路和实验支持。第一部分脂联素缺乏诱导小鼠昼夜节律紊乱及海马组织Bmal1异常表达目的:观察脂联素缺乏是否可诱导小鼠昼夜节律紊乱且导致小鼠海马组织内Aβ沉积及Bmal1异常表达。方法:选取4月龄及12月龄雄性脂联素敲除(APN-KO)小鼠和C57BL/6野生型小鼠,分为Control组、APN-KO组。采用普通PCR技术鉴定APN-KO小鼠基因型;通过免疫组织化学染色法观察12月龄APN-KO小鼠和C57BL/6野生型小鼠海马内Aβ斑块沉积情况;通过跑轮行为学实验分析4月龄APN-KO小鼠和C57BL/6野生型小鼠的跑轮活动节律、自由运转周期和昼/夜活动量比值等指标,并采用Real-time PCR和Western Blotting检测不同CT时间点小鼠海马组织Bmal1基因/蛋白的表达。结果:(1)APN-KO小鼠的基因型鉴定。(2)APN-KO小鼠海马组织中存在Aβ沉积。(3)APN-KO小鼠存在昼夜节律紊乱。(4)APN-KO小鼠海马组织Bmal1基因/蛋白表达异常。结论:脂联素缺乏可引起小鼠昼夜节律紊乱,小鼠海马组织内Aβ沉积及Bmal1基因/蛋白异常表达。第二部分脂联素改善Aβ31-35所致HT22海马神经细胞Bmal1异常表达目的:验证脂联素对Aβ31-35所致HT22海马神经细胞Bmal1异常表达的改善作用。方法:采用小鼠海马HT22神经细胞作为实验对象,将其随机分为Control组、Aβ31-35处理组、APN+Aβ31-35处理组、APN单独处理组。通过CCK8法检测各组细胞存活率;通过Real-time PCR法检测各组细胞不同CT时间点Bmal1基因的表达水平,并采用Western Blotting实验方法检测各组细胞BMAL1蛋白表达水平。结果:(1)Aβ31-35诱导HT22海马神经细胞Bmal1基因/蛋白异常表达。(2)脂联素逆转Aβ31-35所致HT22海马神经细胞存活率下降。(3)脂联素改善Aβ31-35所致HT22海马神经细胞Bmal1基因/蛋白异常表达。结论:脂联素可改善Aβ31-35引起的HT22海马神经细胞Bmal1异常表达。第三部分脂联素通过抑制GSK3β活性改善Aβ31-35所致HT22海马神经细胞Bmal1异常表达目的:探讨GSK3β在脂联素改善Aβ31-35所致HT22海马神经细胞Bmal1异常表达中的作用。方法:选取小鼠海马HT22神经细胞,随机分为Control组、Aβ31-35处理组、LiCl+Aβ31-35处理组、APN+Aβ31-35处理组、APN单独处理组。通过CCK8法检测上述前三组细胞存活率;通过Real-time PCR法检测前三组细胞不同CT时间点Bmal1基因的表达水平;采用Western Blotting方法检测前三组细胞BMAL1蛋白表达水平及上述五组细胞GSK3β表达情况。结果:(1)Aβ31-35诱导HT22海马神经细胞GSK3β活性增加。(2)Aβ31-35部分通过增加GSK3β活性导致HT22海马神经细胞Bmal1基因/蛋白异常表达。(3)脂联素逆转Aβ31-35所致HT22海马神经细胞GSK3β活性增加。结论:脂联素可能通过抑制GSK3β活性进而发挥改善Aβ31-35所致HT22海马神经细胞Bmal1异常表达的作用。