当发生原因不明的传染病时,能否准确及时确定病原体是有效预防和控制传染病,防止疫情扩散的关键。目前我国对传染病病原学检测能力有了长足的进步,但在应对一些未知病原体或者罕见病原体导致的传染病突发疫情时,常常面临着病原难以及时鉴定的难题。即便是针对已存在多年的传染病,现有的检测手段也有着一定的缺陷,需要不断地完善和继续开发更为有效的检测手段。2009-2010年,在湖北、河南和山东等地一些丘陵地带,相继出现有着类似临床症状的病人,主要表现为发热、消化道症状、血小板减少、白细胞减少及多脏器功能损伤等,病死率高达10-30%,俗称“蜱叮咬病”,急需对病原进行确认。本实验室对2010年5月26日于湖北采集的一患者血清标本进行病原体筛查检测,分离到了一株全新的病毒。并结合序列非依赖单引物核酸扩增(SISPA)技术、RNA末端连接等多种分子生物学技术完成对新病毒的全基因组的序列测定,随后对来自6个省份的患者血清标本中分离到的共11株病毒进行了全基因组测序,并通过生物信息学分析确定病原体为布尼亚病毒科白岭病毒属的新成员。但是该病毒全基因组序列无论是核苷酸还是氨基酸与布尼亚病毒科其他病毒相比均呈现高度差异,与白蛉病毒属其他病毒相比,S片段相对保守,但其氨基酸同源性最高仅可达41%左右,而NS片段变异最大,其氨基酸同源性仅有11%左右；L和M片段氨基酸同源性在21%-36%之间不等。应该属于白蛉病毒属的一个新的分支,最终,“蜱叮咬病”被命名为发热伴血小板减少综合征(SFTS),该病毒被确认为该病的病因,命名为发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)。随着SFTS病原体的确定,病例的逐渐增多,为了能早期、快速、准确的诊断SFTSV的感染,以便及时给予正确治疗以降低疾病的病死率,我们建立了实时定量RT-PCR病毒核酸检测方法。为了提高实验的灵敏性和特异性,我们同时选取新型布尼亚病毒S、M、L三个基因片段的高度保守区为靶区域,设计了三组特异性引物及荧光探针,通过一步法荧光RT-PCR扩增对血清或血浆样本中新型布尼亚病毒核酸进行检测,并通过制备RNA参比品对样本进行定量检测。为了避免出现假阴性和便于进行质控,我们选取无关的绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建了基于逆转录病毒载体的病毒样颗粒做为非竞争性的内参比品,该内对照可于核酸提取前加入原始样本,用于监测包括核酸提取和PCR扩增的整个流程,最终通过对确诊样本的检测验证了该方法的灵敏性和特异性。目前该方法已完成临床试验,正在申报生产文号,为SFTS的早期诊断提供了有效手段。为了探索SFTS的发病机制,我们利用luminex液态芯片技术检测了患者血清中的27种细胞因子,通过比较患者和正常人之间、死亡患者与治愈患者之间、急性期患者和恢复期患者之间细胞因子水平的区别,发现干扰素的水平在病人与正常人之间无差异,IP-10、Eotaxin、IL-10、G-CSF,IL-1β、IL-15显著增高,IL-6、IL-8、IL-1ra、MCP-1、MIP-1α有不同程度的增高,PDGFBB、RANTES、VEGF较正常人下降,结果分析表明,SFTSV病毒感染后血清中多种细胞因子水平发生变化,有些细胞因子的改变程度与疾病的预后有一定相关性。在对新发疾病的病原体进行筛查时,需要在最短的时间内排除已知的病原体,由于病毒分离是实验室诊断病毒感染的金标准,我们尝试改进病毒分离的检测方法,由之前的观察细胞病变或由免疫荧光实验来判断是否有病毒感染转为是否有报告蛋白的表达。我国是肾综合征出血热发病最多的国家,分离汉坦病毒是HFRS防控和科研工作中的重要内容。我们将绿色荧光蛋白(EGFP)的基因取代汉坦病毒L、M、S三个片段编码区基因,以病毒特异的启动子样序列来控制报告基因的表达,然后反向克隆到具有RNA聚合酶I的启动子和终止子的载体中,构建了于L、M、S片段的微复制子,然后将微复制子分别转染汉坦病毒感染的Vero-E6细胞,观察EGFP的表达量,结果发现3个片段的NCRS均可以启动微复制子的转录和复制,但表达量较低,其中以M片段的启动子功能稍强,虽然该体系达不到用于判断是否所有病毒感染的目的,但可以为以后的研究打下基础,通过在DNA水平上对非编码区进行插入、缺失、突变、等操作可用来探索非编码区的调控机制,为汉坦病毒的反向遗传研究提供思路。由于病毒性出血热种类繁多,一一排除既浪费标本又浪费时间,而普通的多重PCR方法经常会出现扩增偏倚,我们借助GeXP的技术平台设计了一套8重PCR方法,拟同时检测沙粒病毒科、布尼亚病毒科、黄病毒科、丝状病毒科中可引起出血热的15种病毒；并加入Kanr基因的RNA做为判断整个反应体系是否正常。并用本科室保存的汗坦病毒毒株和登革4型毒株,以及用体外转录CCHF和lassa病毒的RNA为模板对整个反应体系中做了初步验证,综上所述,本研究既成功地获得了发热伴血小板综合征的全基因序列,建立了有质控的real-time PCR检测其核酸的方法,比较了患者与健康人之间细胞因子的差异,又探索了新型的以报告基因表达与否判断是否有病毒感染的病毒分离方法,初步建立了以GeXP为基础的检测15种病毒性出血热病毒的8重PCR方法。为病毒性出血热的未知病毒和已知病毒的检测提供了新的思路。