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前列腺癌( Prostate Cancer )是欧美国家常见的恶性肿瘤,占男性癌症死亡人数第二位。我国前列腺癌发病率虽远低于欧美国家,但近年来也逐年增高,已列为男性泌尿系肿瘤的第三位。前列腺癌对人类健康的威胁变得越来越严重。人们在重视传统的手术治疗,激素治疗,放、化疗等治疗手段的同时,也在寻找新的治疗方法。二十世纪九十年代基因治疗的兴起,开辟了肿瘤治疗的新途径。目前,已有多种基因治疗方案得到初步应用,同时研究人员仍在不断寻找新的治疗基因。A20,最初在人脐静脉内皮细胞中发现,被认为是肿瘤坏死因子α( TNF-α)可诱导的初级应答基因。随后人们克隆了A20基因,序列分析发现其编码产物为一种锌指蛋白。在人类乳腺癌MCF-7细胞、鼠成纤维细胞瘤WEHI164细胞、鼠胚胎成纤维NIH3T3细胞、胰岛β细胞和人脐静脉内皮细胞中,A20稳定地高表达能够抑制TNF诱导的凋亡。但是在人肝癌HepG2细胞,肺上皮A549细胞,人宫颈癌Hala细胞中,刺激因子刺激后A20并未呈现出高表达,因而认为A20不具有保护这些细胞的能力。一些细胞系受到A20的保护而另一些细胞未能受到保护的原因还不清楚。目前有关A20与肿瘤关系的研究还很少。RNA干扰( RNA interference,RNAi )指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA ( double stranded RNA,dsRNA )时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象,这种现象发生在转录后水平,又称为转录后基因沉默( post transcriptional gene silencing,PTGS )。目前,RNAi以其特有的高效性和特异性而广泛应用于基因功能和基因治疗的科学研究中。本研究首先通过RT-PCR ( reverse transcription-polymerase chain reaction )和Western blot技术检测了人前列腺癌细胞PC-3、PC-3M、DU145、LNcap和22RV1中A20 mRNA和蛋白水平的表达。RT-PCR和Western blot结果显示,五种人前列腺癌细胞系中均有A20的表达,其中PC-3和PC-3M中mRNA和蛋白水平较高,22RV1中较低(p<0.01)。因此,A20在PC-3细胞中的高表达为下一步进行的RNAi实验研究的细胞模型的选择奠定了基础。根据A20基因序列和siRNA设计原则,设计并合成了三对互补的寡核苷酸片断。经变性、退火后形成三个能表达小发夹RNA ( small hairpin RNA,ShRNA)的DNA片断。每个DNA片断分别与pSilencer3.1-H1 hygro载体连接,得到RNA聚合酶Ⅲ启动子H1启动的重组siRNA表达载体pSilencer3.1-A1,pSilencer3.1-A2和pSilencer3.1-A3,重组siRNA表达载体经双酶切鉴定和DNA序列测定后,转染PC-3细胞,潮霉素进行稳定克隆筛选。用RT-PCR和Western blot技术检测了A20的表达水平变化,用流式细胞仪、MTT法检测了A20基因表达沉默后,PC-3细胞的抗凋亡能力,分化、增殖能力的变化。RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组和pSilencer3.1-NC转染的PC-3细胞相比,重组质粒pSilencer3.1-A1和pSilencer3.1-A3有效的阻断了A20的表达,而重组质粒pSilencer3.1-A2转染的PC-3细胞中A20表达水平没有明显的变化;与未转染组和pSilencer3.1-NC转染的PC-3细胞相比,pSilencer3.1-A1和pSilencer3.1-A3转染的细胞的凋亡率分别增加了11.9%和7.7%,而转染后细胞的生长速度和细胞周期没有明显的变化。本研究初步证明了A20基因在人前列腺癌PC-3细胞中高表达且具有抗凋亡作用,为进一步证实A20是否能成为前列腺癌基因治疗的新靶点的研究工作奠定了基础。