YvoA蛋白对苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因表达调控的研究

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迄今为止,几丁质酶基因(chitinase, chi)表达调控在链霉菌中的研究和报道最为详尽,然而包括苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)在内的芽胞杆菌几丁质酶基因的表达调控机制知之甚少。实验室前期的研究对Bt75几丁质酶基因(chiA和chiB)上游序列进行一系列缺失突变,结果发现该序列中存在一个16bp的位点,与顺式作用元件“dre”(多效调节因子DasR蛋白的应答元件,该蛋白在链霉菌中可以调控几丁质酶的表达)十分相似,缺失或者破坏这个位点导致原本诱导型表达的启动子变为组成型表达。由此可见,该位点很有可能结合类似DasR的调节因子。通过氨基酸序列比对,发现在Bt中存在与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis,简称Bs)YvoA(与DasR有40%的一致性)极为相似的蛋白编码基因,因此我们推测该蛋白通过与dre位点的结合调控Bt几丁质酶基因的表达。  本研究克隆、表达、纯化了Bt75的YvoA蛋白。凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)、等温滴定量热法(ITC)、pull-down实验均证实,纯化的YvoA蛋白(大肠杆菌表达)能与含dre位点的40bp DNA序列特异性结合。其次,敲除Bt75菌株的yvoA基因,获得的突变菌株Bt75△yvoA与原始菌株相比在基础培养基中的几丁质酶活力升高7.1倍,且几丁质酶基因的表达由诱导型变为组成型;几丁质酶基因的chiA mRNA的相对表达量提高1.5倍,chiB提高6.7倍。至此,可以确定YvoA蛋白作为转录调控因子通过与dre位点的结合抑制苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因的表达。  通过PREDetector软件分析发现苏云金芽胞杆菌基因组中还存在其它的dre位点,如核糖核酸酶Z(Ribonuclease Z)基因(-99~-114)、青霉素结合蛋白(Penicillin-binding protein)基因(-63~-78)和ABC转运子ATP结合蛋白(ABCtransporter ATP-binding protein)基因(-81~-96)的上游调控区都发现有类似dre位点的序列。Real-time PCR证实突变菌株Bt75△yvoA中3个基因的mRNA相对表达量都有不同程度的提高,EMSA证实YvoA蛋白可与这3个基因上游含dre位点的序列特异结合。因此,结合体内(in vivo)、体外(in vitro)和电脑分析(in silico)的结果,可以得出YvoA蛋白的作用不仅仅局限于调控GlcNAc的代谢,还可能参与其它基因的表达调控。  此外,EMSA实验结果表明小分子单糖GlcN-6-P可以阻遏Bt75 YvoA蛋白与DNA的相互结合,因此该分子很可能为YvoA蛋白的有效诱导物能够解除YvoA蛋白对几丁质酶基因的阻遏作用。并且我们使用SWISS-Model对Bt75YvoA蛋白进行同源建模后通过分子对接软件Discovery Studio2.5证实了二者能够结合的结果,具体的诱导机制还需要进一步研究。
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