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脂肪酶(Lipase,EC.3.1.1.3)是作用于甘油酯键的酶,既能专一性水解甘油酯键,释放更少酯键的甘油酯或甘油以及脂肪酸;又能在无水或少水体系中进行逆水解反应,即酯化反应。低温脂肪酶的最适反应温度为35℃左右,在0℃仍然保持一定催化活性。与中高温脂肪酶相比,低温催化有利于保持热敏感产物的特性、降低生产能源消耗。此外,低温脂肪酶有机溶剂耐受性良好,pH适应性宽,对长链甘油酯具有更高的催化活性。其在食品、洗涤、制药、脂类加工、环境修复等领域的应用中具有显著优势,是近年来脂肪酶研究的热点。目前,低温脂肪酶的应用面临着菌种资源缺乏、酶活力低、热稳定性差等挑战,因此从微生物中挖掘新型低温脂肪酶具有重要意义。本论文从海洋环境中获得产低温脂肪酶菌株,对其进行异源表达、分子改造和菊酯类农药降解研究,具体内容如下: 从海洋环境中筛选得到产低温脂肪酶菌株SCSIO25071,通过实验鉴定,表明它属于Aeromicrobium属成员。最佳产酶培养基为:基础培养基中添加1%葡萄糖,1%鱼粉和0.1%阿拉伯树胶。当起始pH值为8.0,装液量为30%,200rpm和28℃时,其胞外酶活最大达到572U/L,比基础培养基中提高了1.2倍。 经过基因组挖掘和异源克隆表达,从Aeromicrobium sp.SCSIO25071菌株中获得一个新型低温脂肪酶Lip98。序列比对发现Lip98与来源于Rhodococcus jostii RHA1的脂肪酶序列一致性最高达49%,但其保守五肽序列(GHSEG)不同于已发现的14个脂肪酶家族和超家族,Lip98可归结成脂肪酶新家族。聚丙烯酰氨凝胶电泳检测显示,经过Ni-NTA亲和层析纯化获得电泳级纯酶,其分子量与预测基本一致,约为30kDa。Lip98最适反应温度和pH分别为30℃和7.5,并且该酶表现良好的低温催化能力,在0℃保留着35%相对酶活。Lip98在55℃的半衰期为8.5min左右,其15-30℃之间的活化能为4.12kcal/mol。Lip98具有良好的有机溶剂耐受性,在100%正己烷中孵育12h仍然保持100%的酶活。 同源建模后,扫描催化三联体Ser154-Asp254-His284周围5(A)范围内共28个氨基酸残基,分别突变成性质相反的氨基酸残基,获得酶活提高的突变体S82A、G154A和Q286A。进行饱和突变,获得酶活提高到2倍的突变体Q286F。丙氨酸扫描NC-loop上每个氨基酸对酶稳定性的影响。在NC-loop的插入片段中构建删除突变体。55℃热处理10min获得残留酶活明显提高的突变体C△6和C△9。复合突变获得了催化活性和热稳定性均提高的复合突变体Lip98/C△9-Q286F。其最适反应温度提高到35℃,50℃的半衰期t1/2从22.8min提高到46.8min,其kcat/Km提高到原来的2.6倍,实现了酶活和热稳定共进化。 以EstAβ为锚定蛋白,将Lip98/C△9-Q286F在大肠杆菌细胞表面展示。其在pH7.0-8.0中对顺式氯氰菊酯和高效氟氯氰菊酯降解率最高,分别达到90%和70%;其最适降解温度为37℃,低温下仍保留降解活性;2.5mM底物反应18h后顺式氯氰菊酯的降解率最高,36h后高效氟氯氰菊酯降解率最高;在ddH2O、海水和磷酸缓冲液(pH7.0)中降解率较高,在自来水中降解率最低。