论文部分内容阅读
脂肪酶(Lipase，EC.3.1.1.3)是作用于甘油酯键的酶，既能专一性水解甘油酯键，释放更少酯键的甘油酯或甘油以及脂肪酸;又能在无水或少水体系中进行逆水解反应，即酯化反应。低温脂肪酶的最适反应温度为35℃左右，在0℃仍然保持一定催化活性。与中高温脂肪酶相比，低温催化有利于保持热敏感产物的特性、降低生产能源消耗。此外，低温脂肪酶有机溶剂耐受性良好，pH适应性宽，对长链甘油酯具有更高的催化活性。其在食品、洗涤、制药、脂类加工、环境修复等领域的应用中具有显著优势，是近年来脂肪酶研究的热点。目前，低温脂肪酶的应用面临着菌种资源缺乏、酶活力低、热稳定性差等挑战，因此从微生物中挖掘新型低温脂肪酶具有重要意义。本论文从海洋环境中获得产低温脂肪酶菌株，对其进行异源表达、分子改造和菊酯类农药降解研究，具体内容如下: 从海洋环境中筛选得到产低温脂肪酶菌株SCSIO25071，通过实验鉴定，表明它属于Aeromicrobium属成员。最佳产酶培养基为:基础培养基中添加1％葡萄糖，1％鱼粉和0.1％阿拉伯树胶。当起始pH值为8.0，装液量为30％，200rpm和28℃时，其胞外酶活最大达到572U/L，比基础培养基中提高了1.2倍。 经过基因组挖掘和异源克隆表达，从Aeromicrobium sp.SCSIO25071菌株中获得一个新型低温脂肪酶Lip98。序列比对发现Lip98与来源于Rhodococcus jostii RHA1的脂肪酶序列一致性最高达49％，但其保守五肽序列(GHSEG)不同于已发现的14个脂肪酶家族和超家族，Lip98可归结成脂肪酶新家族。聚丙烯酰氨凝胶电泳检测显示，经过Ni-NTA亲和层析纯化获得电泳级纯酶，其分子量与预测基本一致，约为30kDa。Lip98最适反应温度和pH分别为30℃和7.5，并且该酶表现良好的低温催化能力，在0℃保留着35％相对酶活。Lip98在55℃的半衰期为8.5min左右，其15-30℃之间的活化能为4.12kcal/mol。Lip98具有良好的有机溶剂耐受性，在100％正己烷中孵育12h仍然保持100％的酶活。 同源建模后，扫描催化三联体Ser154-Asp254-His284周围5(A)范围内共28个氨基酸残基，分别突变成性质相反的氨基酸残基，获得酶活提高的突变体S82A、G154A和Q286A。进行饱和突变，获得酶活提高到2倍的突变体Q286F。丙氨酸扫描NC-loop上每个氨基酸对酶稳定性的影响。在NC-loop的插入片段中构建删除突变体。55℃热处理10min获得残留酶活明显提高的突变体C△6和C△9。复合突变获得了催化活性和热稳定性均提高的复合突变体Lip98/C△9-Q286F。其最适反应温度提高到35℃，50℃的半衰期t1/2从22.8min提高到46.8min，其kcat/Km提高到原来的2.6倍，实现了酶活和热稳定共进化。 以EstAβ为锚定蛋白，将Lip98/C△9-Q286F在大肠杆菌细胞表面展示。其在pH7.0-8.0中对顺式氯氰菊酯和高效氟氯氰菊酯降解率最高，分别达到90％和70％;其最适降解温度为37℃，低温下仍保留降解活性;2.5mM底物反应18h后顺式氯氰菊酯的降解率最高，36h后高效氟氯氰菊酯降解率最高;在ddH2O、海水和磷酸缓冲液(pH7.0)中降解率较高，在自来水中降解率最低。