水稻逆境相关基因OsWRKY97和OsDUF946.4的功能分析

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本文的研究内容主要包括两个部分:1)水稻OsWRKY97基因功能研究2)水稻OsDUF946.4基因的克隆及功能的初步探索。水稻是重要的农作物之一,然而随着环境的不断恶化,干旱,盐碱,极端温度等都是限制植物生长的重要因子,同时也是影响作物产量的主要因素,因此研究植物对非生物胁迫的响应过程显得尤为重要。目前,水稻基因组研究的重点已从结构基因组学转向功能分析。新基因的发现以及功能的验证则是功能基因组学研究中的重要部分。本研究将对两个与逆境相关的水稻基因的功能进行研究,主要的研究内容和结果如下:1.WRKY转录因子被发现在水稻生长发育,生物胁迫以及非生物胁迫等方面都发挥着重要作用。在这里,我们鉴定了WRKY转录因子家族的一个新成员OsWRKY97,并分析了它在非生物胁迫中的作用。实验发现,OsWRKY97过表达植株在萌发期,萌发后期以及幼苗生长期的耐旱性都比野生型日本晴植株高。这说明OsWRKY97对水稻的抗旱性有积极的调节作用。35S启动子启动的OsWRKY97和GFP融合蛋白在烟草中的瞬时表达结果发现其在烟草细胞的细胞核位置出现强烈的绿色荧光。我们的研究还发现与野生型日本晴相比,OsWRKY97表达植株在种子萌发期以及萌发后期对外源脱落酸(ABA)也表现出较高的敏感性。因此我们猜测OsWRKY97是通过ABA依赖途径来调节水稻的耐旱性。实验结果发现在干旱胁迫下,OsWRKY97的过表达增加ABA的积累量,同时减缓叶片失水速率。这一结果印证了上述猜测。此外我们还发现与野生型日本晴相比OsWRKY97过表达植株脯氨酸含量高,丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平降低。活性氧清除酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性增加以维持细胞内活性氧的稳态。这些结果均说明了OsWRKY97在水稻干旱胁迫响应中起着重要作用,在提高水稻抗旱性方面具有潜在的应用价值。2.未知功能的结构域(Domain of unknown function,DUF)是一种蛋白结构域,这类蛋白结构域大多数是保守的,但功能未知植物中存在着一些特异性的的DUFs蛋白家族,这些蛋白在植物生长发育以及应答防御反应等多个生物学过程中发挥着重要的作用。本研究通过克隆了一个逆境候选基因OsDUF946.4,其开放阅读框为1653bp,编码个氨基酸残基。编码的多肽分子量为59KDa,等电点为6.1。并通过Plant CARE在线启动子分析,发现其有多种与逆境相关的顺势作用元件。通过定量qRT-PCR对OsDUF946.4基因在水稻中的表达模式分析,发现其表达能被不同的逆境诱导,属于多逆境诱导基因。为了进一步的验证其在非逆境胁迫的作用,我们构建了pCAMBIA1301S-OsDUF946.4过表达载体,pCAMBIA1305-OsDUF946.4启动子表达载体,pCAMBIA2300-e GFP-OsDUF946.4过表达载体以及pET32a(+)-OsDUF946.4表达载体。并获得了过表达植株以及启动子植株。通过农杆菌介导的烟草细胞的瞬时表达显示,OsDUF946.4亚细胞定位在质膜和细胞核中。此外我们还发现p ET32aOsDUF946.4融合蛋白在大肠杆菌中的表达能够增加大肠杆菌的耐旱性和耐盐性。初步验证了OsDUF946.4在非逆境胁迫的反应中有着重要的作用。
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