论文部分内容阅读
食品安全问题已引起全球的高度关注。在我国,三聚氰胺(MEL)已被列入生乳收购及乳制品产品出厂必检项目。三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化工中间体,因具价格低廉,广泛使用在建筑材料和油漆中,不法商人因其分子中氮含量较高,而违法添加到食品中,增加含氮量。三聚氰胺违法添加到奶制品中,严重损害了人们的健康。目前,酶联免疫检测法(ELISA)简便、快速,适合大规模样品筛选,但国内检测三聚氰胺的ELISA试剂盒主要依靠价格高昂的国外试剂盒,严重制约着ELISA法的推广。研制具有自主产权的快速检测三聚氰胺ELISA试剂盒,已成为监测MEL非法使用的当务之急。本研究在分析三聚氰胺分子结构和免疫原性的基础上,通过两种不同的方法:一是改造三聚氰胺结构类似物合成羧基化MEL半抗原,半抗原与载体蛋白偶联合成三聚氰胺人工抗原。二是由于三聚氰胺本身携带的氨基可直接与载体蛋白偶联合成三聚氰胺人工抗原。将合成用免疫原进行紫外和抗原抗体竞争结合鉴定,将偶联比高的免疫原免疫兔子,获得抗三聚氰胺血清,将抗三聚氰胺血清进行鉴定纯化后,用于直接ELISA并对其条件进行优化,从而建立直接ELISA快速检测三聚氰胺的方法,研制试剂盒并进行试剂盒验证,主要研究结果如下:1.免疫原采用多种化学方法进行合成。将原料2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪合成羧基化MEA,采用活性酯法和氯甲酸异丁酯法偶联羧基化MEA获得免疫原(MEA-BSA)和包被原(MEA-OVA)。利用三聚氰胺氨基采用戊二醛法直接与BSA合成人工抗原(MEL-BSA1和MEL-BSA2)。经测定简单EDC法的半抗原与载体蛋白MEL-BSA偶联比为29.35:1。戊二醛法制备的三聚氰胺人工免疫原的偶联比为:MEL-BSA1为7.25:1;MEL-BSA2为9.06:1;改造后合成的三聚氰胺人工免疫原的偶联比:MEA-BSA为29.63:1。2.用免疫原(MEA-BSA)免疫动物,第5次免疫后用间接ELISA法初步测定兔子抗血清效价为1:2000,抗血清IC50值为45.92ng/mL。3.多克隆抗体纯化并经SDS-PAGE鉴定,紫外分光光度法测得纯化后的多克隆抗体浓度为8.76mg/mL。4.优化ELISA的反应过程中的一些参数,重新建立MEL标准曲线,方程Y=-46.77X+97.27,R2=0.997。经计算MEL的半数抑制率IC50为10.24ng/mL。5.进行试剂盒组装及其对试剂盒的评估,并用高效液相对此试剂盒进行了验证。