脂肪组织被认为是机体最大的能量储存器官,同时也是机体一个重要的内分泌器官。其在能量平衡、动物繁殖、器官保护、性别选择等多个方面具有重要作用。当前,随着鱼粉、鱼油资源量的下降和价格的不断攀升,大豆油、红花油、葵花籽油等富含n-6系列脂肪酸而相对缺乏n-3系列脂肪酸的植物性油脂源被广泛应用于草鱼的商业饲料中。除此之外,为了应对巨大的商业压力,高能商业饲料也广泛被使用以促进养殖鱼类的生长速度,加速其上市时间。然而,高能以及n-6/n-3比率失衡的日粮极易导致养殖鱼类脂肪的过度蓄积,引发诸多问题,如死亡率上升、摄食量下降、免疫力下降、品质降低等,最终影响经济效益。因此,对脂肪过度蓄积的调控显得尤为重要。目前,已有学者通过在体与离体两种模型,对脂肪蓄积的调控进行了一定的研究,发现二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)可以通过促进脂肪细胞凋亡、抑制脂肪合成等途径降低脂肪蓄积,但其具体机制尚不明确。Alpha-亚麻酸(Linolenic acid,ALA)是重要的n-3 PUFAs(polyunsaturated fatty acids)之一,也是草鱼的必需脂肪酸之一。有研究指出,日粮中添加一定量的ALA可以降低脂肪蓄积。鉴于EPA有限的来源而导致的使用限制,以及草鱼具有将C18的ALA转化成EPA的能力,本论文旨在探讨EPA及其前体ALA这两种重要n-3 PUFAs对草鱼脂肪蓄积调控的作用及机制,以期为淡水鱼类脂质代谢提供一定的理论参考。主要研究结果如下:1.EPA影响草鱼腹腔脂肪组织脂质蓄积的在体与离体研究。采用EPA的在体饲喂,结合草鱼脂肪细胞的离体培养,对试验鱼生长、生物学性状、血清生化、脂肪酸组成等进行评估,并采用HE染色、RT-PCR、流式细胞术等检测方法确定了EPA对草鱼脂肪蓄积的具体作用及机制。结果表明:用富含0.52%EPA的日粮饲喂草鱼,其生长并未受到影响。经过3周的饲养,试验鱼的腹腔脂肪指数显著降低,而当饲养时间延长到6周,腹腔脂肪指数无显著差异。同时,在体和离体结果均显示EPA显著促进了脂肪组织/细胞脂肪组织甘油三酯脂酶(ATGL)、激素敏感性脂酶(HSL)-a、过氧化物酶体增殖激活物受体(PPAR)-γ、脂蛋白脂酶(LPL)、caspase 3a、caspase 3b的mRNA水平以及caspase 3的酶活性,下调了肝X受体(LXR)-α、固醇调节原件结合蛋白(SREBP)-1c、脂肪酸合成酶(FAS)的基因表达以及Bcl-2/Bax的比率。离体结果表明,EPA以剂量和时间依赖型的方式抑制草鱼前体脂肪细胞的活力,且当其浓度达到650μM,作用4天时,处理组细胞活力只有对照组的约50%。此时,流式细胞术检测凋亡的结果显示,处理组凋亡率高达37%,显著高于对照组。且ROS含量也显著上升。而抗氧化剂α-生育酚的使用可显著缓解EPA诱导的凋亡。另一方面,EPA的使用可显著促进脂肪组织/细胞的EPA含量。2.epa促进草鱼脂肪细胞表达甘油激酶基因。根据试验一的研究结果,为深入研究epa短期饲喂能降低脂肪含量,而长期饲喂则无此作用的内在机制。首先,克隆了草鱼甘油激酶(gyk)基因部分序列,发现其在肝胰脏、脂肪组织和肾脏中表达最高。随着脂肪细胞的发现,其表达呈现上升的趋势。用100μm的epa处理细胞6、12、24h,发现其能显著促进gyk的基因表达和酶活性,同时atgl和pparγ的基因表达也显著上调。为进一步探究epa诱导草鱼脂肪细胞表达gyk基因的潜在机制,分别以atgl和pparγ的抑制剂hy-15859、gw9662孵育细胞,结果显示此两种抑制剂均能减弱epa对gyk的诱导作用。此外,对细胞进行饥饿24h处理,虽然atgl显著上调,但gyk的酶活性并未发生变化。而包括α-亚麻酸(18:3n-3,ala)、二十二碳六烯酸(22:6n-3,dha)、亚油酸(18:2n-6,lna)在内的pparγ的其余配体脂肪酸,均能促进gyk的基因表达和酶活性。3.日粮添加α-亚麻酸对草鱼稚鱼脂质代谢,脂肪酸组成及腹腔脂肪细胞凋亡的影响。分别用富含0.0%、1.0%、2.0%ala的日粮饲喂草鱼稚鱼8周。结果发现,日粮中添加ala对试验草鱼的生长无负面影响。同时,腹腔脂肪指数在2.0%组最低,而caspase3、caspase8、caspase9的酶活性此组最高。与其他两组相比,2.0%的ala显著下调了fas、srebp-1c的基因表达以及bcl-2/bax的比率。同时,2.0%组试验鱼腹腔脂肪组织出现更多的凋亡样线粒体,主要表现为线粒体肿胀、嵴消失等。另一方面,对脂肪酸生物合成途径的基因表达检测发现,肌肉和肝胰脏中,ala组脂肪酸延长酶(elo)和脂肪酸去饱和酶(fad)的表达显著高于对照组,而在腹腔脂肪组织中也呈现出相反的趋势。然而,日粮中添加ala均能显著促进肌肉、肝胰脏和腹腔脂肪组织的epa和dha的含量。4.α-亚麻酸对草鱼脂肪细胞凋亡的影响及其机制分析。利用草鱼离体脂肪细胞培养平台,用ala分别对草鱼前体以及成熟脂肪细胞进行处理。结果表明,ala(0-800μm)并未对细胞活力产生抑制作用,且当处理时间为2和4天时,ala促进细胞活力。此外,不同分化阶段的前体细胞具有相同的应答模式。分别用100、650、1300μm的ala处理前体细胞2和4天,随着ala浓度的升高,caspase3a、caspase3b和caspase8的mrna水平显著下降,而bcl-2/bax则呈现出相反的变化趋势。而当处理时间延长到8天,caspase9、caspase3b和caspase8的mrna水平在1300μm组最高,而bcl-2/bax在此组最低。对于成熟脂肪细胞,经过2天的处理,随着ala浓度的升高,caspase3a、caspase3b、caspase8和caspase9的基因表达显著下调,而bcl-2/bax则呈现出相反的变化趋势。然而,经过8天的处理,caspase3a、caspase3b、caspase8和caspase9的基因表达显著上调,而bcl-2/bax则呈现出先上升后下降的趋势,且最低值出现在1300μm组。av/pi凋亡染色结果也表明,当处理时间为2和4天时,ala主要表现为抗凋亡,而当处理时间延长到8天,650和1300μm组的凋亡率显著高于其他两组。对于脂肪酸组成的检测发现,用1300μm的ala处理8天,前体脂肪细胞处理组的ala和dha含量显著高于对照组,而成熟脂肪细胞处理组只有ALA的含量显著高于对照组。综上所述,1)日粮中添加适量的EPA在一定条件下可以通过促进甘油三酯水解、促进脂肪细胞凋亡、抑制脂肪酸从头合成等途径降低草鱼腹腔脂肪蓄积;2)不同于哺乳动物,草鱼脂肪组织可以表达GyK基因。EPA通过诱导GyK的表达,促进甘油三酯的重新酯化,从而出现补偿性合成。且EPA对GyK的诱导受到PPARγ的调控,ATGL也参与调控这一过程;3)日粮中2.0%的ALA可以过促进脂肪细胞凋亡、抑制脂肪酸的从头合成等途径降低草鱼腹腔脂肪蓄积。且ALA的添加可以显著促进鱼体肌肉n-3长链多不饱和脂肪酸的沉积,从而提高鱼体的品质;4)ALA本身可以促进成熟脂肪细胞凋亡,而对于前体脂肪细胞,ALA可能通过其生物合成产物发挥作用。草鱼前体和成熟脂肪细胞在利用ALA合成DHA的能力上可能具有差异。