1.研究背景卵巢癌是全世界妇女因妇科癌症死亡的第二大原因。由于起因复杂,早期症状不典型,该病通常在晚期（III期或IV期）被诊断出来,而此时癌细胞已扩散到卵巢外。腹膜是最先被扩散到的位置并可能在此产生腹腔积液,腹水的出现可能是卵巢癌的第一个明显症状。卵巢癌是一种高异质性疾病。即使同一种卵巢癌组织学亚型也可能具有几种不同生物特征和分子特征。卵巢癌的早期治疗主要依赖肿瘤细胞减灭术和铂类/紫杉醇联合化疗;治疗结束后,获得临床缓解的II期及以上或者携带有乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene,BRCA）突变的卵巢癌患者被建议进行维持性治疗,聚（ADP-核糖）聚合酶（poly（ADP-ribose）polymerase,PARP）抑制剂和抗血管生成剂是常见的维持性治疗药物。虽然这些治疗方式可以暂时缓解疾病,但是卵巢癌的复发率却高达85%以上。复发性卵巢癌患者明显对药物更加耐受,使用化疗药物的缓解率不足30%,由于抗癌药物引起显著毒副作用,其使用剂量受到限制。尽管在过去的三十年里,涉及卵巢癌的前沿研究、筛查、手术及治疗方法等取得了巨大进展,但患者的存活率变化不大。因此,迫切需要寻找一种新的、有效的、特异性强且患者可耐受的卵巢癌治疗方案。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）占卵巢恶性肿瘤的95%以上。高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer,HGSOC）作为EOC最常见的组织学亚型,约占70%。TP53突变、BRCA1/2突变以及同源重组修复（homologous recombination repair,HRR）缺陷可能出现在HGSOC中。值得注意的是,PARP抑制剂主要用于卵巢癌患者对含铂类化疗应答后的维持治疗。PARP1/2通过参与碱基切除修复（base-excision repair,BER）途径对DNA单链断裂（single strand breaks,SSB）进行有效修复。PARP1首先被招募到DNA SSB位点,然后在NAD+的参与下,PARP1对自身和其他修复蛋白如XRCC1、CHD4、APLF或CHFD等进行PARylation修饰,促进BER进程。此外,PARP1还参与复制叉损伤的修复。PARP抑制剂不仅能抑制BER进程损害DNA SSB修复,还可以通过抑制PARylation作用阻止PARP1释放,引起持续的DNA双链断裂（double strand breaks,DSB）。这些DNA DSB在携带有HRR缺陷的细胞中往往得不到准确修复,导致基因组不稳定,进而引起细胞死亡。HGSOC可以被分为四种亚型,分别为BRCA1/2胚系突变（germline mutation of BRCA1/2,g BRCA）、BRCA1/2体系突变（somatic mutation of BRCA1/2,s BRCA）、HRR缺陷以及野生型。直接产生或者由于复制叉停滞引起的DNA DSB在携带有BRCA突变或者HRR缺陷的HGSOC中得不到准确修复。即使在不存在HRR缺陷相关突变的野生型HGSOC中,正常的HRR也可能不会发生,导致DNA DSB以低保真性的方式进行修复,最终表现为HGSOC对PARP抑制剂敏感。目前,美国食品和药品管理局（Food and Drug Administration,FDA）已批准三种PARP抑制剂Olaparib、Niraparib和Rucaparib用于初始对铂类治疗有反应的复发性卵巢癌的维持治疗。虽然PARP抑制剂在治疗HGSOC方面显示出良好的治疗效果,但HGSOC对PARP抑制剂原发性耐药或者初始应答者逐渐变得耐药的现象普遍存在,因此迫切需要进一步开发基于PARP抑制剂的组合疗法,帮助更多的HGSOC患者获益于PARP抑制剂的治疗。已有研究表明,细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平的升高可引起DNA损伤,PARP抑制剂通过降低PARP酶活性而破坏这些损伤的修复;此外,PARP抑制剂还可以通过NOX1/4上调细胞内ROS的水平。基因组综合分析显示,大约97%的HGSOC患者存在TP53突变。TP53蛋白功能的丧失与氧化还原失衡有关,氧化还原失衡可能导致细胞内ROS的增加,促进肿瘤细胞的生长。越来越多的研究表明,氧化应激在肿瘤发展或抗癌过程中起重要作用,具有较高ROS水平的细胞可能更容易受到ROS激活剂的攻击。异硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate,PEITC）是一种存在于十字花科蔬菜中的天然化合物,它可以结合细胞内的谷胱甘肽,导致谷胱甘肽库消耗,进而引起细胞内ROS积累。此外,PEITC通过调节多种机制（如EGFR/AKT、NAD+/ATP和PARP等）发挥抗肿瘤作用。值得注意的是,由于参加氧化还原调节和氧化应激反应的因素有很多,肿瘤细胞中的氧化还原状态改变非常复杂,单独使用ROS激活剂可能并不总是导致肿瘤细胞被优先攻击。因此,亟需探索ROS激活剂与其他药物的联合使用方案,以扩大此类药物的受益患者群体。2.研究目的PARP抑制剂已被批准用于卵巢癌的临床治疗,但PARP抑制剂耐药现象普遍存在。越来越多的证据表明,ROS激活剂的使用可能改善药物治疗反应或者克服细胞对某种药物的耐药性。本研究旨在探索ROS促进PARP抑制剂抗肿瘤活性的作用与机制,提供一种治疗HGSOC的潜在候选方式。3.研究方法本研究主要围绕卵巢癌PARP抑制剂治疗的耐药频繁发生,因此迫切需要开发有效的联合用药策略的问题,开展PEITC增强PARP抑制剂治疗HGSOC的有效性和作用机制的研究。本课题选用四种HGSOC细胞系,分别为OVSAHO、SNU119、COV362和OVCAR4;和两种宫颈癌细胞系,分别为Ca Ski和ME180。具体研究通过以下实验开展:（1）细胞增殖试验检测PEITC或BMN 673对四种HGSOC细胞系的生长抑制作用。（2）基于Chou-Talay方法,利用Calcu Syn软件计算PEITC和BMN 673在四种HGSOC细胞系中的药物联用指数。（3）长期克隆形成试验检测过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）、PEITC、BMN 673或者抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine,NAC）对待检测细胞增殖能力的影响。（4）H2O2、PEITC、BMN 673或者抗氧化剂NAC处理四种HGSOC细胞系48小时后,用氧化还原敏感的荧光探针（H2-DCFDA）对不同处理组细胞进行染色。流式细胞仪检测细胞的荧光强度,评估细胞内的ROS水平。（5）H2O2、PEITC或BMN 673处理四种HGSOC细胞系48小时后,用Annexin V/PI对不同处理组的细胞进行染色。流式细胞仪检测不同处理组中Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+细胞百分比,评估细胞凋亡水平。（6）待检测细胞先在无血清培养基中培养8-12小时,再在含有PEITC、BMN673或NAC的培养基中培养24小时,然后收集细胞、固定、进行碘化丙啶（propidium iodide,PI）染色。流式细胞仪检测细胞内的DNA含量以确定不同处理方式对细胞周期分布的影响。（7）使用Lipofectamin TM 3000试剂将质粒[p DR-GFP（addgene#26475）和p CBA-Sce I（addgene#26477）检测HRR;EJ5-GFP（addgene#44026）和p CBA-Sce I（addgene#26477）检测非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）]瞬时转入四种HGSOC细胞系中,然后在含有PEITC和BMN 673的培养基中培养细胞一定时间后,收集细胞。流式细胞仪检测不同处理组中GFP阳性细胞所占的百分比。GFP阳性细胞所占百分比越高,该处理组内细胞的HRR或者NHEJ能力越强。（8）γH2AX是一种DNA损伤的蛋白标志物。PEITC和BMN 673处理四种HGSOC细胞系48小时后,免疫荧光试验检测不同处理组内γH2AX核内聚集情况。（9）Cleaved PARP是一种细胞凋亡的蛋白标志物,PAR反应PARP催化活性。四种HGSOC细胞系经H2O2、PEITC、BMN 673或者抗氧化剂NAC处理48小时后,Western blot分析不同处理组内的Cleaved PARP、γH2AX或者PAR的水平。（10）PEITC和BMN 673处理四种HGSOC细胞系一定时间后,提取不同处理组细胞的染色质组分。Western blot分析不同处理组的PARP1蛋白水平,PARP1信号越强,PARP1捕获能力越强。（11）PEITC和BMN 673处理培养在基质胶中的四种HGSOC细胞系肿瘤球状体一定时间后,在倒置相差显微镜下进行拍照,并对肿瘤球状体结构的完整性进行统计。（12）分离、收集临床新鲜样本（HGSOC患者引流的腹水或者原发宫颈鳞状细胞癌患者的肿瘤组织）内的细胞进行类器官培养。构建好的类器官模型被用来进一步验证PEITC和BMN 673的组合疗效。4.研究结果H2O2引起的氧化应激使HGSOC细胞系对PARP抑制剂敏感。此外,PEITC作为ROS激活剂,与PARP抑制剂BMN 673显示出协同的细胞毒性作用。机制上,PEITC联合BMN 673在HGSOC细胞内诱导ROS的过度产生和积累,以及增强的DNA损伤、G2/M周期停滞和细胞凋亡。所有这些现象都被抗氧化剂NAC显著逆转。虽然PEITC没有进一步增强BMN 673的PARP1捕获能力,但二者的联药效果部分依赖PARP1的存在。重要的是,PEITC和BMN 673组合治疗抑制了HGSOC细胞系肿瘤球状体和患者来源的类器官的生长潜力。5.研究结论我们的研究结果表明,ROS诱导剂PEITC和PARP抑制剂联用,可通过协同诱导ROS的过度积累产生细胞毒性,从而对HGSOC和宫颈癌产生有效杀伤作用。本项研究将为探索基于PARP抑制剂的联合用药方案,以及拓展PARP抑制剂的临床应用范围提供一定理论基础。