端粒是由端粒重复序列和大量与端粒相互作用的结合蛋白组成的复合体，在真核生物线性染色体末端形成类似帽子的结构来维持染色体稳定。端粒DNA由双链和单链G悬突两部分组成，人类的端粒重复单元为TTAGGG。单链悬突会形成D环、T环或者G四联体的高级结构，与端粒相关结合蛋白结合提高稳定性防止染色体末端融合或断裂。由于末端复制的问题，端粒会随着细胞分裂而逐渐缩短。生物体主要靠端粒酶逆转录延伸端粒末端，但端粒酶在大多体细胞中活性很低，当端粒缩短到临界长度时，会导致染色体降解、细胞的衰老和相关疾病的发生等，“生命时钟”的称呼由此而来。因此，端粒的长度是研究端粒的一个重要生物标签。分析端粒长度的方法有很多，目前有较高分辨率和较广应用范围的单个端粒长度分析需要在端粒上游的近端粒区域设计特异引物，再利用PCR扩增端粒片段，进而分析端粒的长度。另一种方法也是基于PCR技术，通过在端粒末端添加接头，结合上游特异引物扩增端粒全长的方法可以精准的获得单个端粒长度，也同样需要获得近端粒序列设计上游引物。　　近端粒是在端粒和基因组核心区域之间的序列，其范围从几kb到几百kb不等，存在个体间的多样性。人类的近端粒包含靠近端粒的段落重复区域，以及和它衔接的染色体特异的非重复区域。由于近端粒区域DNA序列组成的特殊性和基因组内部有大量端粒重复序列存在等原因，大的亚克隆没有覆盖近端粒区域，导致近端粒序列难以定位。NCBI的数据库中，人类基因组全部46个染色体末端中只有17个染色体近端粒能够完成拼接组装，包含与端粒衔接部分序列的组装片段也只有25个。除了在端粒长度分析中的应用，近端粒序列还有例如表观修饰、端粒相关调控和基因的遗传和变异等研究价值。区别于酵母或水稻，人类的端粒和近端粒比较长，这也是造成近端粒克隆测序困难的原因之一。因此，克隆、测序人类的近端粒对于别的物种近端粒克隆或测序有更广泛的借鉴意义。　　本实验设计了6种策略对人类近端粒进行克隆，总结对比了其优劣，旨在建立一种方便高效的近端粒序列克隆方法。采用“随机引物与端粒接头克隆近端粒序列”的方法需要相对低的退火温度，降低了端粒接头的特异性，尽管在水稻中获得了成功，但在人类基因组中扩增了太多的非近端粒片段。“限制性酶切与去G悬突端粒直接克隆近端粒”的方法，理论上避免了PCR扩增产生非特异片段的情况，但是可能由于人类端粒长度太长、连接片段数太少等问题。“限制性酶切接头与端粒重复序列引物克隆近端粒序列”的方法提高了PCR的特异性，但由于基因组内源端粒重复序列的存在，无法直接说明获得片段是否为近端粒序列。“限制性酶切接头与突变端粒序列引物”的策略是对“限制性酶切接头与端粒重复序列引物”降低PCR产物弥散程度的改进，但同样无法排除基因组内源端粒重复序列的干扰。为了克服内源端粒重复序列的干扰，采用“限制性酶切接头与端粒接头”的策略克隆近端粒序列，排除了内源端粒重复序列的干扰，但由于近端粒酶切位点的缺乏和人类端粒平均长度较长的问题，影响PCR的有效扩增。“上游保守序列与端粒接头克隆近端粒序列”利用近端粒区域的同源性和人类染色体末端高频的交叉互换，在已知的染色体近端粒区域设计引物，提高了上游引物的特异性，也排除了内源端粒重复序列的干扰。根据以上方法获得的所有序列，筛选了5条可能性较高的近端粒候选序列，为继续深入研究奠定基础。