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银屑病是一种常见的以皮肤表皮细胞增殖加速、角化不全和真皮淋巴细胞浸润的慢性炎症反应为特征的红斑鳞屑性皮肤病。其中,西医治疗银屑病的内服药疗效差和毒副作用大,而中医治疗银屑病以内服疗效较好且毒副作用小,所以中医治疗银屑病具有一定优势。中医理论认为银屑病的重要病机是血分热,血分热动,耗伤气血,血虚风燥,血热互结。因此,临床上凉血润燥,活血养血的理血剂是治疗银屑病的常用方药理念。银屑灵二方（PSORI-CM02）是在广东省中医院卢传坚教授在国医大师禤国维教授治疗银屑病的经验方银屑灵的基础上进行优化的中药方剂,临床主要用于治疗血热瘀结型银屑病。本课题组前期研究已经发现在银屑病患者皮肤中has-miR-99a改变明显,而hsa-miR-99a表达异常可能导致银屑病角质细胞的异常增殖和分化。由此,本研究从整体观念出发,采用动物实验和细胞实验来探讨PSORI-CM02治疗银屑病的分子免疫机制。本研究分为四个部分:第一部分,PSORI-CM02对咪喹莫特（imiquimod,IMQ）诱导银屑病模型小鼠的干预作用;第二部分,PSORI-CM02对IMQ诱导银屑病模型小鼠的机制研究;第三部分,PSORI-CM02对白介素-22/白介素-17A（Interleukin-22/Interleukin-17A,IL-22/IL-17A）诱导银屑病模型细胞的作用研究;第四部分,PSORI-CM02对IL-22/IL-17A诱导银屑病模型细胞的机制研究。目的:探讨PSORI-CM02方调控microRNA-99a抑制银屑病角质细胞增殖的机制研究方法:第一部分实验:将30只Balb/c小鼠背部除去2 cm×3 cm毛发区域,随机分为正常组,模型组（IMQ,50 mg/只）,PSORI-CM02 低剂量组（1 g/kg）,PSORI-CMO2高剂量组（1.5 g/kg）和甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX,0.154 mg/kg）组。给药组预给药3天后（正常组和IMQ组用等体积饮用水灌胃）,模型组和给药组用IMQ连续涂抹小鼠背部7天,正常组涂抹等量的凡士林。造模第1天、第3天、第5天、第7天进行银屑病面积与严重性指数（Psoriasis Area and Severity Index,PASI）评分、称量体重和检测表皮皮肤温度。第7天取材观察表皮皮肤和脾脏情况。取各小鼠背部皮损区皮肤进行RT-PCR检测白介素-23（Interleukin-23,IL-23）mRNA、白介素-8（Interleukin-8,IL-8）mRNA、趋化因子 C-C-基元配体 20（Chemokine C-C-Meta ligand 20,CCL20）mRNA、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）mRNA表达水平,HE检测皮肤厚度。第二部分实验:将30只Balb/c小鼠背部除去2 cm×3 cm毛发区域,随机分为正常组,模型组（IMQ,50 mg/只）,PSORI-CM02低剂量组组（1 g/kg）,PSORI-CMO2高剂量组（1.5 g/kg）和MTX（0.154 mg/kg）组。给药组预给药3天后（正常组和IMQ组用等体积饮用水灌胃）,模型组和给药组用IMQ连续涂抹小鼠背部7天,正常组涂抹等量的凡士林。第7天取各小鼠背部皮损区皮肤进行RT-PCR检测mmu-miR-99a-5p（miR 99a）表达,western blot检测 p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-IKKα/IKKα、p-NF-κ B p65/NF-κ B p65、p-Stat3/Stat3 表达,免疫组化检测 mTOR表达。第三部分实验:采用IL-22与IL-17A细胞因子联合刺激人永生化角质形成细胞（human immortalized keratinocytes,HaCaT）,诱导 Th17 细胞活化的银屑病体外模型。将HaCaT角质细胞分为5组,分别为正常组,模型组,PSORI-CM02低剂量组（1 mg/mL）,PSORI-CM02 高剂量组（2 mg/mL）,MTX 组（40 μM）。模型组是加入 IL-17A（20 ng/mL）、IL-22（20 ng/mL）刺激 6 h,给药组是加入 PSORI-CM02 或 MTX,与IL-17A（20 ng/mL）、IL-22（20 ng/mL）共同刺激6 h 后收样。RT-PCR 检测IL-23 mRNA,IL-8 mRNA,CCL20 mRNA 和 TNF-α mRNA。第四部分实验:将HACAT分为2大分组,分别利用miRNA 99a过表达或抑制质粒作用于体外炎症状态下角质形成细胞,观察PSORI-CM02的作用机制。第一大组（6组）:空白载体对照组（CON 组）,miRNA 99a inhibitor 载体组（CON 99a inhibitor组）,模型空白载体对照组（Model组）,模型miRNA 99a inhibitor载体组（Model 99a inhibitor组）,PSORI-CM02空白载体对照组（2 mg/mL组）,PSORI-CMO2 miRNA 99a inhibitor 载体组（2 mg/mL 99a inhibitor 组）。第二大组（6 组）:为空白载体对照组（CON组）,miRNA 99a mimic载体组（CON 99a mimic组）,模型空白载体对照组（Model 组）,模型 miRNA 99a mimic 载体组（Model 99a mimic 组）,PSORI-CM02空白载体对照组（2 mg/mL 组）,PSORI-CM02 miRNA 99a mimic 载体组（2 mg/mL 99a mimic 组）,空白对照载体为 mimic ncontrol。第一大组,miRNA 99a inhibitor（100 nmol/L）或 inhibitor ncontrol（100 nmol/L）转染 48 h 后,模型组加入 IL-17A（20 ng/mL）与 IL-22（20 ng/mL）刺激 6h。给药组加入 PSORI-CM02（2 mg/mL）,IL-17A（20 ng/mL）与 IL-22（20 ng/mL）共同刺激 6h 后收样。第二大组,miRNA 99amimic（50 nmol/L）或 mimic ncontrol（50 nmol/L）转染 48h 后,模型组加入 IL-17A（20 ng/mL）与 IL-22（20 ng/mL）刺激 6h。给药组加入 PSORI-CM02（2 mg/mL）,IL-17A（20 ng/mL）与 IL-22（20 ng/mL）共同刺激 6 h 后收样。RT-PCR 检测 hsa-miR-99a-5p（miR 99a）,IL-23 mRNA,IL-8 mRNA,CCL20 mRNA,TNF-α mRNA,mTOR mRNA 的表达。Western blot检测p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-IKKα/IKKα、p-NF-κB p65/NF-κ B p65、p-Stat3/Stat3 的蛋白表达。结果:第一部分实验:与正常组相比,模型组小鼠出现皮瘠,红斑,鳞屑等皮损现象,体重下降,脾脏增大,皮肤温度升高;模型组的背部皮损炎症因子IL-23 mRNA、IL-8 mRNA、CCL20 mRNA、TNF-α mRNA表达水平显著上调（P<0.05）。与模型组相比,PSORI-CM02组和MTX组小鼠的皮瘠,红斑,鳞屑等皮损现象减轻,还有体重下降,脾脏增大及皮肤温度升高现象有所缓解;PSORI-CM02组和MTX组的背部皮损炎症因子IL-23 mRNA、IL-8 mRNA、CCL20 mRNA、TNF-α mRNA 表达水平显著下调（P<0.05）。第二部分实验:与正常组相比,模型组的小鼠背部皮肤增厚现象明显,mTOR阳性率表达显著上升（P<0.05）,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-IKKα/IKKα、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-Stat3/Stat3 的比例显著增大（P<0.05）,miRNA 99a 表达显著下降（P<0.05）。与模型组相比,PSORI-CM02组和MTX组的小鼠背部皮肤增厚现象有所减缓,mTOR阳性率表达显著下降（P<0.05）,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-IKKα/IKKα、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-Stat3/Stat3 的比例显著下降（P<0.05）,miRNA 99a表达显著上升（P<0.05）。第三部分实验:与正常组比,模型组IL-23 mRNA,IL-8 mRNA,CCL20 mRNA,TNF-α mRNA表达显著上升（P<0.05）。与模型组比,各浓度的PSORI-CM02组IL-23 mRNA,IL-8 mRNA,CCL20 mRNA 和 TNF-α mRNA 表达显著下降（P<0.05）。第四部分实验:抑制miR 99a的表达可以使PSORI-CM02对银屑病模型细胞的干预作用的减弱,即与2 mg/mL组比,2 mg/mL 99a inhibitor组的IL-23,IL-8,CCL20,TNF-α 的含量增加（P<0.05）,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-IKK α/IKK α、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-Stat3/Stat3 的比值显著增大（P<0.05）。而过表达 miR 99a可以使银屑病模型细胞的模型指征不明显,即与Model组比,Model 99a mimic组的IL-23,IL-8,CCL20,TNF-α 的含量减少（P<0.05）,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-IKKα/IKKα、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-Stat3/Stat3 的比值显著减小（P<0.05）。结论:PSORI-CM02抑制银屑病角质细胞增殖和抑制Th17细胞的效应因子如IL-23,IL-8,CCL20,TNF-α的表达,说明PSORI-CM02对本实验动物及细胞模型均有明确的治疗及改善作用,可能是与上调miR 99a的表达抑制其靶蛋白mTOR,抑制mTOR/Stat3通路及抑制Akt/IKK α/NF-κB p65通路的激活有关。