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木瓜凝乳蛋白酶(Chymopapain)是番木瓜乳汁中的一种半胱氨酸蛋白酶,具有凝乳和蛋白水解能力.由于番木瓜乳汁中的几种半胱氨酸蛋白酶具有相似的结构、性质和底物特异性,木瓜凝乳蛋白酶的特异性检测和高纯度分离纯化都存在一定的困难.为了更好地进行木瓜凝乳蛋白酶的检测和分离纯化,该课题进行了该酶基因工程单链抗体的制备研究.用木瓜凝乳蛋白酶免疫BALB/c小鼠,待血清达到理想效价后,取其脾脏提取到完整的RNA,RT-PCR法扩增出高产量的、大小分别为366bp和324bp的V<,H>和V<,L>基因片段.纯化回收的V<,H>和V<,L>在接近等摩尔浓度下,用重叠延伸拼接法以连接肽相连组装成单链抗体基因,获得大小为735bp的目的片段.scFv经SfiⅠ和NotⅠ双酶切,与经同样双酶切的噬粒载体pFAB5c连接,电转化法转化大肠杆菌XL1-blue,转化率为6.90×10<6>/μgDNA,转化克隆经M13K07辅助噬菌体援救后,得到滴度为1.6×10<5>cfu/mL,库容为1.46×10<6>的中等大小的噬菌体抗体库.在此基础上,以木瓜凝乳蛋白酶为靶抗原对原是的噬菌体抗体库进行了4轮"吸附-洗脱-援救"的富集过程,从而得到滴度为7.4×10<7>cfu/mL的次级噬菌体抗体库.用木瓜凝乳蛋白酶包板通过ELISA法分别对噬菌体培养上清进行筛选,共筛选克隆40个,获得反应阳性克隆3个.用IPTG对ELISA阳性最强的克隆进行可溶性抗体的诱导表达,并用SDS-PAGE、双抗体夹心ELISA法对表达产物作进一步鉴定,发现所表达的单链抗体分子量约为28KD,能与木瓜凝乳蛋白酶起特异性免疫反应.对该阳性克隆插入片段的测序结果用NCBI中的Nucleotide Blast分析,证实所包含的重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白γ重链基因同源性达96﹪,轻链可变区基因和小鼠免疫球蛋白轻链κ基因同源性达98﹪.上述结果表明,我们已经在国内外首次成功地构建了抗木瓜凝乳蛋白酶scFv噬菌体抗体库,筛选到目的蛋白克隆,并诱导表达了抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体,能有效检测木瓜凝乳蛋白酶,为将来进一步构建其他类型的抗木瓜凝乳蛋白酶基因工程抗体以及木瓜凝乳蛋白酶分离纯化方面的应用奠定了基础.