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目的:
建立糖尿病合并动脉粥样硬化大鼠内皮功能障碍模型,研究Rho激酶与内皮功能障碍之间的关系,探讨Rho激酶抑制剂法舒地尔对内皮功能的影响。
方法:及内容:
1、实验分组
健康雄性WISTA大鼠25只,6-8周龄,200-220g,随机选取5只,作为正常对照组(NC组),余20只建立糖尿病合并动脉粥样硬化模型后随机均分成阳性对照组(PC组)和药物干预组(DI组)。
2、造模方法
采用尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病大鼠,此基础上维生素D3灌胃3天,同时给予高脂饲料喂养5周后,糖尿病合并动脉粥样硬化大鼠模型建立成功。
3、药物干预
20只大鼠模型建立后随机分成阳性对照组和药物干预组2组:阳性对照组继续高脂饲料喂养,同时予以生理盐水腹腔注射,共4周;药物干预组继续高脂饲料喂养,同时予以予以法舒地尔10mg/kg/d腹腔注射,共4周。
4、标本留取
实验结束时,麻醉大鼠,腹主动脉取血5ml,静置1小时,2500bp离心10min,取上清液分装4管,每管50-70ul,留1管立即测血糖,余-80℃冷柜保存;剪下心脏,取左心室,洗净血液,于甲醛中固定;取主动脉组织约100mg两块,洗净血液,分装两管,于-80℃冷柜保存;另取主动脉组织2.0×2.0×0.3cm大小,洗净血液,于甲醛中固定。
5、检测指标
血糖仪测全血血糖;酶法测血清血脂(LDL-C、TC、TG、HDL-C); HE染色观察病理组织结构;ELISA技术测内皮功能指标eNOS、ET-1; western blot技术测ROCK底物蛋白MYPT-1的磷酸化水平;RT-PCR技术测定RhoA及ROCK的mRNA表达水平。
所有试验数据均采用平均值±标准差表示。所有统计数据用SPSS19.0软件分析,取P<0.05有统计学意义。
结果:
1、血液生化指标
PC组与NC组相比,血糖明显升高(26.36±3.25 vs6.18±1.14,p<0.05);TG明显升高(1.82±0.10vs1.01±0.10,p<0.05),TC明显升高(7.64土1.031 vs2.67±0.21,p<0.05),LDL-C明显升高(6.14±1.22 vs1.09±0.18,p<0.05);ET-1表达明显升高(88.2±5.3 vs72.1±7.1,p<0.05),eNOS的表达明显减低(17.4±1.8vs24.4±2.5,p<0.05)。DI组与PC组相比,血糖明显减低(17.70±2.69vs26.36±3.25,p<0.05);TG明显减低(1.56±0.139vs1.82±0.096, p<0.05)、TC明显减低(6.26±0.43vs7.64±1.03,p<0.05),LDL-C明显减低(4.76±0.57vs6.14±1.22, p<0.05);ET-1的表达减低(75.5±2.9 vs88.2±5.3,p<0.05),eNOS的表达明显升高(22.8±2.3vs17.4±1.8,p<0.05)。
2、病理组织形态学
NC组主动脉形态正常,内皮细胞连接紧密,无脂质条纹或纤维斑块,内膜完整,无炎性细胞浸润;PC组动脉内膜细胞肿胀向内突出,有程度不等的增厚,内膜下可见空泡,增厚内膜主要由大量泡沫细胞、平滑肌细胞组成,内膜下发生广泛粥糜样改变,外膜下炎性细胞浸润,内皮细胞损伤脱落,脂质沉积,斑块形成;DI组主动脉内膜略肿胀,稍增厚,泡沫细胞较少,无明显内皮细胞脱落。
3、Western blot结果
PC组与NC组比较,ROCK1底物蛋白MYPT-1的磷酸化水平明显升高(1.70±0.60 vs0.5±0.28,p<0.05);DI组与PC组比较,p-MYPT-1的表达明显减低(0.82±0.45 vs1.70±0.60,p<0.05)。
4、RT-PCR结果
PC组与NC组比较,RhoA及ROCK的mRNA水平明显升高(0.83±0.12 vs0.16±0.20,0.78±0.13 vs0.4±0.18,p<0.05);DI组与PC组比较,RhoA及ROCK的mRNA水平明显减低(0.25±0.07 vs0.83±0.12,0.40±0.08vs0.78±0.13,p<0.05)。
结论:
1、Rho激酶在糖尿病合并动脉粥样硬化大鼠主动脉内皮中高表达。
2、Rho激酶与主动脉内皮功能密切相关。
3、法舒地尔通过抑制Rho激酶的表达,改善内皮功能,延缓糖尿病合并动脉粥样硬化疾病进展。