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研究目的目前,黑色素瘤已经成为全球发病率增长最快的恶性肿瘤之一。肿瘤转移导致传统治疗方法不能取得理想的效果,因此,有效抑制肿瘤转移可以改善黑色素瘤的治疗效果。EMT在肿瘤转移、干细胞性、耐药性中发挥重要作用,因此寻找EMT相关的负调控因子,对恶性肿瘤的预防和预后都具有重要意义。蛋白4.1B是一种骨架蛋白,已有研究表明在多种肿瘤中蛋白4.1B呈现不同程度的表达下调或缺失,可能是一种潜在的肿瘤抑制因子。我们在前期研究中发现4.1B在B16和B16-F10细胞中均呈现表达缺失,构建pEGFP-N1-EPB41L3真核表达载体,探究4.1B在黑色素瘤细胞转移中的作用。将外源性的EPB41L3基因转染4.1B缺失表达的黑色素瘤细胞系,探讨其对细胞的增殖和迁移能力的影响,以及在B16皮下移植瘤和B16-F10肺转移中的作用,并初步探索4.1B调控黑色素瘤细胞EMT的分子机制。方法1.PCR和western blot技术筛选蛋白4.1家族在黑色素瘤细胞B16和B16-F10中的表达情况;荧光定量PCR进一步检测EPB41L3基因的表达情况。2.构建pEGFP-N1-EPB41L3真核表达载体,转染B16和B16-F10细胞,荧光显微镜观察蛋白4.1B在黑色素瘤细胞内的定位情况,PCR、荧光定量PCR以及western blot实验方法检测蛋白4.1B的表达情况。3.MTT法检测蛋白4.1B对黑色素瘤细胞体外增殖的影响,细胞划痕实验检测蛋白4.1B对其迁移能力的影响。4.荧光定量PCR和western blot技术检测EMT相关标志物E-cadherin、vi mentin、MMP-2、MMP-9的表达情况。荧光定量PCR检测启动EMT相关的T GF-β家族成员、转录因子Snail、Slug、Twist 2基因的表达量。5.荧光定量PCR技术检测蛋白4.1B对integrinβ1基因水平表达量的影响。流式细胞术检测蛋白4.1B对细胞表面integrinβ1的表达以及活化的影响。6.B16皮下移植瘤模型以及B16-F10肺转移模型评估蛋白4.1B的抑癌功能。结果1.小鼠黑色素瘤细胞系B16和B16-F10中,4.1R、4.1N、4.1G在核酸和蛋白水平均正常表达,但是蛋白4.1B在两种细胞中都呈现表达缺失。2.成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-EPB41L3,EPB41L3基因转染细胞后荧光显微镜镜检,可观察到绿色荧光。PCR、荧光定量PCR和western blot技术检测结果显示EPB41L3基因转染后细胞均表达4.1B。3.蛋白4.1B对黑色素瘤细胞系B16和B16-F10细胞的体外增殖以及迁移具有抑制作用。4.蛋白4.1B表达后,上皮型标志物E-cadherin的表达出现明显上调,间充质型标志物vimentin、MMP-9的表达出现下调。蛋白4.1B可能通过抑制转录因子Snail、Slug、Twist 2基因的表达抑制EMT。5.蛋白4.1B对细胞表面integrinβ1的表达和活化没有影响。6.蛋白4.1B对B16皮下移植瘤和B16-F10肺转移具有一定的抑制作用。结论蛋白4.1B对B16和B16-F10细胞的增殖和迁移具有抑制作用,并且能够通过下调相关转录因子Snail、Slug、Twist 2的表达水平,调节EMT相关标志物E-cadherin、vimentin、MMP-9的表达,从而抑制黑色素瘤细胞EMT,抑制肿瘤细胞的转移。动物实验结果进一步证实了蛋白4.1B能够显著性抑制B16皮下移植瘤的生长,对小鼠肺转移模型中B16-F10的肺转移也具有一定的抑制作用。