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基于荧光探针的荧光成像技术以其高灵敏度、高选择性、对细胞无损伤以及制备方便等优点而成为生物成像应用最重要的手段之一。然而,目前已报道的荧光探针在生物成像中仍存在一些缺陷:(1)大部分荧光探针采用紫外-可见光激发,在成像应用时可能会遭受内源物质背景荧光的干扰,同时还会导致光漂白、光致毒和组织穿透差等问题;(2)大多数荧光探针是利用其荧光强度变化来进行检测,而单波长荧光强度变化容易受到光漂白、周围微环境(pH、极化、温度等)、探针自身浓度及检测仪器等多种因素的影响,致使检测信号失真;(3)虽然比率型荧光探针在近年来逐渐增多,然而大部分比率型荧光探针的发射位移小,重叠严重,导致分辨率较低。因此,发展近红外激发的具有大发射位移的新型比率荧光探针具有非常重要的研究意义。本论文设计、合成了两类比率荧光探针,分别应用于细胞及组织中H2S和pH的成像检测。具体内容如下:(一)在第二章中,设计并合成了基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)机理的H2S比率型双光子荧光探针。将胺基萘酮染料作为双光子激发能量供体,对H2S响应的花色素类似物染料作为能量受体,通过刚性桥连接,合成了一种小分子比率型双光子荧光探针,命名为TR-H2S。TR-H2S具有两个高分辨的发射带,发射位移高达125nm。当探针与H2S接触后,由于H2S与探针分子的受体部分花色素类似物发生亲核加成反应,破坏其能量受体的π共轭体系,FRET过程受阻,从而使得能量受体荧光减弱,同时能量供体荧光增强。通过两个发射带信号的对比,实现了对H2S的快速响应和比率检测,也成功应用于细胞和组织中H2S的双光子比率成像检测。(二)在第三章中,设计并合成了基于分子内电荷转移(intramolecular charge transfer,ICT)机理的线粒体靶向近红外比率型pH荧光探针。将2-(2-羟基苯基)苯并噻唑引入到CC近红外染料结构中,合成了四个对pH敏感的近红外荧光染料BTCS1-4。在酸性条件下,染料发射波长较短的荧光,随着pH增加,羟基脱质子形成具有强供电子能力的氧负离子,导致染料的吸收和发射光谱皆发生红移。实验结果表明,BTCS1在不同pH条件下都表现出较好的发射光谱分辨率,并且其甲酯化衍生物(BTCS-pHmito)主要靶向在线粒体,因此,基于BTCS1合成的近红外荧光探针在线粒体pH检测时具有潜在的应用价值。