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肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是一种以发热、出血、急性肾功能损害为特征的急性传染病，通常由汉坦病毒（Hantaviruses，HTV）感染引起，在世界范围内广泛分布，中国是世界上发病人数最多的国家，而陕西省为我国 HFRS的高发地区之一。长期以来，我国通过对重点疫区人群进行疫苗接种预防HFRS的发生，因此需要对HFRS疫苗的免疫效果进行定期评价。抗汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）抗体特别是中和抗体（neutralizing antibody，NAb）可直接与HTNV结合，参与机体对病毒的免疫清除。鼠源性抗体因为异源性反应很难应用于人体，目前很少有人源性抗体用于 HFRS的紧急预防和治疗，因此，制备具有潜在中和活性的人源性抗体十分必要。本研究在评价了 HFRS抗体检测试剂盒和疫苗接种者免疫接种效果的基础上，建立了疫苗接种者的 B淋巴母细胞系（Blymphoblastoidcell lines，BLCLs）。将NAb阳性的疫苗接种者和HFRS患者的BLCLs抗体基因重组到噬菌体载体上，建立噬菌体Fab抗体库，筛选HTNV特异性抗体和中和活性抗体，经表达、纯化和鉴定获得了具有潜在中和活性的人源性抗HTNV Fab抗体，为HFRS的紧急预防、治疗以及疾病的诊断提供新的途径。为此，我们进行了以下实验： 第一部分：HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化 首先，基于HTNV抗体检测的需要，评价了国产与进口HFRS IgG抗体ELISA试剂盒的性能，结果表明国产试剂盒敏感性高，进口试剂盒特异性强。然后，采集疫苗接种者的血液标本，应用EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）转化技术建立了70株疫苗接种者BLCLs，检测了疫苗接种者的血清标本和BLCLs培养上清中HTNV特异性抗体，评价了咸阳地区 HFRS疫苗接种的免疫效果。疫苗接种人群血清中HTNV核蛋白（nucleocapsid protein，NP）特异的IgM、IgG抗体以及HTNVNAb的水平和阳性率明显升高，三者具有较好的相关性；最强烈的抗体分泌反应发生在接种疫苗后3个月，与血清检测结果一致，表明针对HFRS的疫苗免疫接种计划在中国西北地区人群中可以有效地诱导体液免疫应答。最后，明确了NAb阳性的BLCLs（占44%）并对BLCLs进行了克隆化，NAb阳性的35株BLCLs（HFRS疫苗接种者与科室保存的患者 BLCLs）为构建具有潜在中和活性的噬菌体抗体库提供基因资源；BLCLs的成功克隆化有望为单克隆抗体制备开辟新的途径。 第二部分：抗HTNV噬菌体Fab抗体库的构建和筛选 提取NAb阳性BLCLs的mRNA并合成cDNA，应用噬菌体展示技术建立了库容量为1.3×109的抗HTNV噬菌体Fab抗体库，Fab的阳性插入率为95%，抗体序列正确率为68%。以HTNV全抗原为靶分子，用固相筛选法经过4轮“吸附-洗脱-扩增”，对洗脱的噬菌体滴度进行测定，结果显示回收率明显增加。筛选前随机克隆测序正确率为68%，第4轮筛选后随机克隆测序正确率为81%；筛选前多样性为95%，第4轮筛选后多样性为31%。经Phage-ELISA检测，最终从第3、4轮筛选的50个克隆中选出了15个序列正确的特异性强的HTNV噬菌体Fab抗体。通过此部分实验，我们成功构建了抗HTNV噬菌体Fab抗体库并对其进行了筛选。 第三部分：人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达和中和活性检测 将第二部分筛选获得的特异性HTNV Fab噬菌体转染Ecoli.HB2151，诱导表达制备可溶性HTNV Fab抗体，并应用亲和层析法进行纯化。表达及纯化产物经还原电泳检测分析，发现在约25kDa处出现明显目的条带，与Fab的预期大小相符。间接ELISA表明这些可溶性HTNV Fab抗体均能与HTNV特异性结合。病毒中和实验结果显示3个Fab抗体具有中和活性。测序分析了15个Fab抗体轻链和重链可变区氨基酸序列，结果表明这些Fab抗体分属于6个抗体家族，大多数轻链和重链属于V3和V4家族，以IGKV3-20*01、IGHV4-59*01家族为主。同源性分析显示，3个具有中和活性的 Fab抗体基因序列来自人胚系基因，未发现与其完全相同的抗体基因序列。 第四部分：HTNV感染巨噬样人急性单核细胞白血病细胞系（differentiated THP-1， dTHP-1）诱导内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ER stress）反应HTV感染机体后可诱导强烈的免疫应答，但其致病机制尚未明确，我们从ER stress的角度，初步观测了HTNV感染对dTHP-1内质网应激的影响。检测结果显示HTNV感染 dTHP-1细胞后，其内质网应激标志性分子葡萄糖调节蛋白（78kDa glucose-regulated protein，GRP78）的mRNA和蛋白水平、X盒结合蛋白1（X box-binding protein1，XBP-1）的mRNA水平均明显升高，表明HTNV感染可以诱导dTHP-1启动ER Stress。而在病毒感染后2h，C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的 mRNA水平在病毒感染组与未感染组无明显差异；凋亡检测结果显示，HTNV感染dTHP-112h后细胞未发生明显凋亡；这些结果提示HTNV诱导的ER Stress在病毒感染早期（12h内）并未直接导致dTHP-1凋亡。